专利名称：用非多肽环一磷酸腺苷水平调节剂诱导排卵的方法排卵是从卵巢释放出一个卵子或多个卵子的过程。月经周期的排卵时间是受精的首要因素。普遍认为，卵泡受到垂体促性腺激素刺激生长和成熟后具有排卵能力。卵泡刺激素(FSH)主要负责卵泡生长，而黄体生成激素(LH)刺激排卵。卵泡受促性腺激素刺激成熟的协调过程确保了排卵时排出感受态卵子。该准备充分的卵子在排卵后数小时内再与精子受精。排卵是一个精确时控的过程，由卵巢的垂体促性腺激素刺激驱动，并通过卵泡对促性腺激素刺激生长和生化(例如类固醇生成、抑制素分泌等)应答而被修饰。在妇女的正常月经周期期间，这些激素呈周期模式。月经周期按功能可分为三个时期卵泡期、排卵期和黄体期。上一个非妊娠周期的黄体期结束，则卵泡期开始，先于或与月经开始同时发生。 一个周期开始，FSH在血液中的水平瞬时上升，刺激一批卵泡发育。采集的生长卵泡直径约为5毫米。在自然月经周期中，通常在卵泡期中建立一个大或优势卵泡，使它生长至成熟。 被考虑可以排出的人卵泡的直径约15毫米或以上。在卵泡期中卵巢内发生的第二件关键事件是卵泡内粒细胞获得LH受体，从而逐渐增大对LH的应答。首先，卵巢慢慢分泌雌二醇和雌酮，随着卵泡直径增大以及卵泡对LH 的灵敏度增加而增多。雌激素和抑制素水平相对升高，造成下丘脑分泌促性腺激素释放激素(&iRH)和垂体分泌促性腺激素。在LH峰前一天雌激素的产生到达最高水平，对雌激素升高和孕酮浓度缓慢增加的神经内分泌应答是排卵前释放促性腺激素，下文将作进一步讨论。在排卵期期间，对雌激素和孕酮的神经内分泌应答发生改变。在周期此时，雌激素上升引发排卵前血清中出现FSH和LH峰，这是由于对下丘脑的正反馈造成的，此时雌激素刺激&iRH水平迅速上升，随后FSH和LH从垂体释放出来。促性腺激素峰诱导卵泡成熟完成，并使优势卵泡或格雷夫氏卵泡破裂，在出现LH峰之后约16至M小时排出卵子。在排卵前出现峰之后的期间内，血清雌二醇水平暂时下降，血浆孕酮水平开始上升。在排卵之后，后排卵的卵泡细胞受LH影响而黄体化，形成黄体，即是黄体期。月经周期中黄体期的诊断标记物是黄体分泌的孕酮明显增多，以及应答孕酮中出现的子宫的变化。与黄体孕酮生成相关的是，血清雌激素水平增幅较少。在黄体期的大部分时间内，LH和 FSH随着孕酮和雌激素上升而下降。接近非妊娠月经周期的黄体期结束，黄体消退，而血清 FSH水平开始上升，启动下一个周期的卵泡生长。FSH和LH以各自刺激卵泡发育或排卵的能力来相互区别。众所周知，两者均能刺激胞内cAMP浓度增大。业已表明，与cAMP相似的两种药剂，例如弗司扣林(forskolin)或 cAMP稳定类似物，在体外具有与FSH对未成熟卵泡的粒细胞的类似作用，以及具有与LH对成熟卵泡的细胞的类似作用。虽然有人提出FSH和LH的可替换胞内通道，但cAMP被刺激是应答该两种促性腺激素的观点已被普遍接受。如果和当cAMP水平的升高与卵泡发育和卵泡成熟有关时，排卵诱导取决于细胞类型和各自的受体是否存在。事实上已经证明，缺乏特定磷酸二酯酶的小鼠排卵受损，而且粒细胞对促性腺激素的灵敏度减弱。目前临床采用的不孕症治疗结合上述一些调控事件。氯米芬(clomiphene)是刺激卵泡生长，并可用于治疗不排卵的其中一种药剂。氯米芬是一种非类固醇抗雌激素，在雌激素的结合位点上与雌激素竞争。一般认为，氯米芬与下丘脑和垂体内的雌激素受体结合， 并且阻断卵巢雌激素施加的负反馈。此结果造成卵泡早期促性腺激素(FSH和LH)生成增加。氯米芬的作用是增加内源性FSH血清水平以及改善卵泡生长和成熟。内源性LH或者外源性LH/CG再诱导这些患者排卵。除了氯米芬之外，用排卵诱导方案治疗妇女，包括市售的人促性腺激素制剂，包括卵泡刺激素(FSH)和黄体生成激素(LH)或者绒毛膜促性腺激素(CG)，所有这些激素最初是通过纯化妊娠妇女的尿而获得的，最近则利用重组技术获得。通常，这种治疗方法在刺激卵泡生成和类固醇生成方面极为有效。治疗引起的并发症是因为这些制剂和方案能够过度刺激卵泡发育和卵泡成熟所致。在一小组患者中，其卵巢被过度刺激，导致超数排卵，最后发生多胎出生。卵巢过度刺激不但威胁到母亲的生命安全，而且往往造成新生儿出生体重低， 这样一些新生儿需要加强护理。一般认为，促性腺激素诱导的过度刺激和多胎妊娠引起的主要并发症可能是hCG的作用时间延长所致。另外，在排卵诱导方案中使用促性腺激素可导致在注射部位有反应，包括局部性或全身性。因此，与使用高效注射药剂的治疗相比，研究使用口服有较弱类促性腺激素活性的活性药剂的排卵诱导方案可能产生显著有益的效果。更重要的是，如果可以开发排卵诱导方案，使卵巢过度刺激减少，从而降低对母亲的危险以及生产健康新生儿，它具有明显的优点。
本发明第一方面提供非多肽环一磷酸腺苷(cAMP)水平调节剂，优选是磷酸二酯酶(PDE)抑制剂，更好是PDE4抑制剂在制备诱导患者排卵的药物中的应用。本发明第二方面提供非多肽环cAMP水平调节剂，优选是PDE抑制剂，更好是PDE4 抑制剂在诱导患者排卵中的应用。本发明第三方面提供非多肽cAMP水平调节剂，优选是PDE抑制剂，更好是PDE4 抑制剂在制备一种治疗方案中诱导患者排卵的药物中的应用，在所述方案中，诱导排卵之前先用氯米芬或芳香酶抑制剂诱导卵泡成熟，优选的芳香酶抑制剂选自YM-511、来曲唑 (Ietrozole)、法倔唑(fadrozole)和阿那曲唑(anastrazole)，更好是选自来曲唑和阿那曲唑。本发明第四方面提供非多肽cAMP水平调节剂，优选是PDE抑制剂，更好是PDE4抑制剂在一种治疗方案中诱导患者排卵中的应用，在所述方案中，诱导排卵之前先用氯米芬或芳香酶抑制剂诱导卵泡成熟，优选的芳香酶抑制剂选自YM-511、来曲唑、法倔唑和阿那曲唑，更好是选自来曲唑和阿那曲唑。本发明第五方面提供一种用于诱导排卵的试剂盒，该试剂盒包括排卵诱导剂量的非多肽cAMP水平调节剂，优选是PDE抑制剂，更好是PDE4抑制剂，和诱导排卵的使用说明书。本发明第六方面提供一种用于排卵诱导和/或辅助生殖技术(ART)的试剂盒，该试剂盒包括足够的每日剂量的FSH和/或具有FSH作用的化合物，优选是氯米芬或芳香酶抑制剂，更好是选自YM-511、来曲唑、法倔唑和阿那曲唑的芳香酶抑制剂，以引发卵泡成熟， 和排卵诱导剂量的非多肽cAMP水平调节剂，优选是PDE抑制剂，更好是PDE4抑制剂，以及该试剂盒在诱导排卵或ART中的使用说明书。本发明第七方面提供非多肽cAMP水平调节剂，优选是PDE抑制剂，更好是PDE4抑制剂在一种治疗方案中诱导患者排卵中的应用，在所述方案中，还给予hCG或LH诱导排卵， 而给予的hCG或LH剂量与正常情况下诱导同一个患者排卵所需的hCG或LH量相比是降低的。本发明涉及提高雌性宿主生育能力的方法，所述方法包括把非多肽环一磷酸腺苷 (cAMP)水平调节剂给予该雌性宿主。本发明另一方面提出在排卵周期的黄体期之前特异性给予非多肽cAMP水平调节剂，诱导优势成熟卵泡排卵。优选的非多肽cAMP水平调节剂包括磷酸二酯酶(PDE)抑制剂，特别是磷酸二酯酶4同种型的抑制剂。虽然PDE抑制剂在体外对粒细胞中LH刺激的类固醇生成的影响已有报导，但本发明叙述两个新发现。首先，PDE抑制剂在体内不能增强FSH刺激的卵泡生长，尽管FSH和LH 细胞通道中cAMP的作用已为人所接受。此外，有证据显示，PDE抑制剂在体外能够增加促性腺激素刺激的类固醇生成，这进一步说明了 PDE抑制剂对LH依赖性排卵有新的活性。第二，在缺少添加LH或hCG的情况下，PDE抑制剂在体内增加排卵率。考虑到PDE抑制剂的口服活性，第二个发现为排卵诱导中首次可能采用非注射方案提供了基础，因为PDE抑制剂可与下文所述的现有方案结合使用。本发明还提出在给予非多肽cAMP水平调节剂之前刺激卵泡发育，包括在宿主排卵周期的卵泡期期间给予能增大FSH浓度的药剂。本发明增加FSH的目的仅涉及卵泡发育和成熟，并不涉及排卵诱导。优选的药剂包括FSH本身、氯米芬、选择性雌激素受体调节剂、 芳香酶抑制剂和神经内分泌调节FSH生成的选择性调节剂。本发明另一方面提供在雌性宿主排卵周期的黄体期之前共给予非多肽cAMP水平调节剂与LH或绒毛膜促性腺激素(CG)。共给予可先后或同时发生，输送方式可相同或不同 (例如肠胃外和/或口服)。另外，与现有排卵诱导方案中使用的LH或CG浓度相比，本发明使用的给予宿主的LH或CG的浓度更低，从而减少卵巢过度刺激的可能性。本发明还提供非多肽cAMP水平调节剂作为治疗药剂在体外受精采集卵母细胞中取代或增强hCG或LH的作用中的应用。所以，本发明提供非多肽cAMP水平调节剂作为一小分子治疗剂(例如磷酸二酯酶抑制剂)的应用，其以口服而非注射方式给予，对于蛋白质按要求的途径给予，在现有排卵诱导方案中按给药方式给予。口服给药避免了与注射相关的急性和全身性副作用。最重要的是，小分子治疗剂诱导排卵是有效的，可单独给予或者与LH或CG结合或不结合，可选择的LH或CG的浓度比现时使用的浓度低，因此，较少机会发生卵巢过度刺激及其相关危险。 故可防止母亲和新生儿出现多胎出生和有生命威胁的并发症。另外，本发明还提供比现有涉及使用CG的排卵诱导方案更早的妊娠诊断测试机会。本发明的治疗方法将用于治疗人和其他哺乳动物(例如马和牲畜，譬如牛、绵羊、 奶牛等)及其他物种例如鱼类(譬如鱼)和鸟类((譬如鸟)的不孕症。图1所示为人的通用排卵诱导方案的示意图。图2所示为磷酸二酯酶抑制剂(即化合物1和化合物2、在体外对增加粒细胞胞内cAMP水平的影响的柱状图。图3所示为磷酸二酯酶抑制剂(即化合物1)在体内对大鼠卵泡成熟的影响的柱状图。图4所示为磷酸二酯酶抑制剂(即化合物1)在体内对大鼠用CG排卵的影响的柱状图。图5所示为磷酸二酯酶抑制剂(即化合物1)在体内对大鼠用或不用CG排卵的影响的柱状图。图6所示为磷酸二酯酶抑制剂(即化合物2)在体内对大鼠用或不用CG排卵的影响的柱状图。图7所示为磷酸二酯酶抑制剂(即化合物2~)对口服和皮下给药之后排卵的影响的柱状图。图8所示为磷酸二酯酶抑制剂化合物3对口服和皮下给药之后排卵的影响的柱状图。图9所示为磷酸二酯酶抑制剂化合物4在体内对次有效剂量hCG存在或不存在下排卵的影响的柱状图。图10所示为磷酸二酯酶抑制剂化合物2对排卵和生育的影响的柱状图。
Τττ . ο“黄体生成激素(LH) ”指由垂体释放出来的一种激素，起着使优势卵泡释放卵子和刺激黄体分泌孕酮的双重作用。“降低浓度”指当与所给予药剂的标准水平相比，该药剂的给予浓度降低。在本发明上下文中，给予的LH和CG的浓度比现有排卵诱导方案低。“现有排卵诱导方案”指目前诱导排卵的方法，包括使用氯米芬、促性性激素 (例如FSH、LH和CG)或这些药剂的组合，以促进不排卵雌性卵泡生成和诱导排卵。这些方案在药剂的给药时间、频率和浓度是可变化的。该定义包括对现有方案的修改，但在排卵诱导方案期间的某些时间点仍需要给予hCG或LH。纳入关于雌性不孕症、刺激的卵泡生成和排卵诱导的下列论文作为参考R印roductive Endocrinology, Surgery, and Technology, Volumes 1 and2 ；Editors :E.Y. Adashi, J. A. Rock and Z.Rosenwaks ； Lippincott-RavenPublishers,Philadelphia, 199 ；Female Infertility Therapy Current Practice ；Editors :Z.Shoham,C. M. Howies and H. S. Jacobs ；Martin Dunitz Ltd,London, 1999。“绒毛膜促性腺激素(CG) ”指一种生理和免疫上与垂体LH相似的糖蛋白激素。在正常妊娠中，CG由胎盘产生，因为其水平在血清浓度中升高，故可用作妊娠的诊断标记物。 缩写hCG是指人绒毛膜促性腺激素。“增大FSH浓度的药剂”指物质、蛋白或合成化学物质的任何组合物，当被给予雌性宿主时，通过给予FSH本身或一种能刺激其内源性产生或抑制其内源性降解的药剂，它能直接或间接地增大血清中FSH的浓度。该词组和药剂的定义包括可能不会增大FSH浓度， 但具有刺激素生物功能和活性的化合物。II.排卵诱导方案的原则自上世纪六十年代以来已经确认，不足够或不适当促性腺激素水平等问题是造成排卵障碍的原因。使用的各种促性腺激素制剂的临床效果与FSH的给予量成比例。最初证据显示，在排卵诱导期间获得足够的排卵生成不需要外源性LH。然而，越来越明显的是，仅给予外源性FSH的妇女无法产生足够的卵泡雌二醇进行排卵诱导。在人进行排卵诱导时至少给予一定量的外源性或内源性LH似乎是重要的。图1所示为通用排卵诱导方案的示意图。最初7天每日给予75IU FSH制剂。第7天结束，进行超声波扫描评估卵泡直径，并测定血清雌二醇水平。如果卵泡直径少于12毫米，将FSH剂量增加一倍，在下一个5至7天期间进行超声波扫描。卵泡直径> 15毫米的患者接受排卵推注剂量的hCG。III.通用排卵诱导方案排卵诱导是一门结合科学的艺术。虽然有很多治疗方案，但没有一种方法或特定的方案是唯一正确的。某些原则确实是适用的，但也只提供了安全有效治疗的基础。然而， 应当注意，以下陈述的诱导排卵标准仅作为举例说明目的，可随着临床情况、患者本人及治疗目的而有很大变化。第一个周期通常涉及在月经结束第4天至第7天开始每日给予FSH。通过雌激素水平和超声波监测卵泡生长和反应。连续7至14天给予FSH —般可达到足够的卵泡刺激。 用FSH治疗少于8天会增加妊娠患者的自然流产率。一旦获得足够的卵泡发育(有2个16至18毫米的卵泡，而且血清雌激素逐渐上升至500-1，000pg/ml)，才给予hCG(5，000或10，000IU)。hCG的给予时间非常重要，这是因为 hCG的作用时间延长可能导致促性腺激素诱导的过度刺激和多胎妊娠引起的主要并发症。 虽然hCG的半衰期约为8小时，但注射后7至10天在患者的血液中还可被检测到，并有可能被误诊为妊娠治疗获得成功。给予hCG之后，指示夫妇在当晚性交，而接下来的48小时还需要作多1或2次性交。关于给予促性腺激素的基本准则是每个治疗周期必须因人而异，并要监测和作适当调整。监测不仅对增加排卵和妊娠率是必要的，而且对于减少严重的卵巢过度刺激，其产生的可能后果及多胎妊娠也是不可缺少的。这可通过经常测定血浆/血清雌二醇水平和超声波检查卵巢来达到。雌二醇水平一般与生长卵泡数有关，但与成熟卵泡数无必然联系。依靠雌二醇水平作为卵泡成熟的标记物，在有多个小卵泡存在下可能会错误提示卵泡已经成熟，以致在成熟前给予hCG。因为卵泡生长与卵子成熟直接相关，所以超声波评估平均卵泡直径可作为评估卵泡成熟及hCG 给予时间的较好指标。因此，雌二醇水平应该用来评估早期卵泡发育，作为对促性腺激素反应的指标，超声波应用来评估成熟卵泡的数目和尺寸。大部分治疗的目的是使单胎妊娠的可能性最大化，同时减少过度刺激综合征的风险。雌二醇水平在1000至1500pg/mL之间似乎是最佳的，但实际水平可取决于使用的实验室和医生的经验。患上过度刺激的风险随雌二醇水平上升而增加。通常，当血清雌二醇超过2000pg/mL，给予hCG时应该十分谨慎，或者应停止给予以便使卵泡退回。低促性腺激素性功能减退症在妊娠周期患上数值大于M00pg/mL的严重过度刺激的风险是5%，在非妊娠周期是1%。此外，因为过度刺激倾向与已有的卵泡数相互关联，所以停止给予hCG的决定还可基于用超声波发现有10个或以上的发育卵泡这一结果。纳入下列关于雌性不孕症、刺激的卵泡生成和排卵诱导的论文作为参考 Reproductive Endocrinology, Surgery, and Technology, Volumes 1 and 2 ；Editors E. Y. Adashi, J. A. Rock and Z. Rosenwaks ；Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia, 199 ；Female Infertility Therapy Current Practice ；Editors :Z.Shoham, C. M. Howies and H. S. Jacobs ；Martin Dunitz Ltd, London,1999。IV.本发明的方法本发明涉及一种排卵诱导的方法，包括在一种排卵诱导方案中给予非多肽cAMP 水平调节剂，给予该调节剂可以增强或取代通常在诱导或自然排卵周期的黄体期之前给予的hCG(或LH)。调节剂可单独给予或者与hCG(或LH)同时或先后共给予，输送方式可以不同(例如肠胃外和/或口服)。本发明另一方面提供在雌性宿主排卵周期的黄体期之前，同时或先后共给予非多肽cAMP水平调节剂与LH(或CG)。另外，因为一般相信hCG的作用时间延长可能导致促性腺激素诱导的过度刺激和多胎妊娠引起的主要并发症，所以本发明提供给予宿主所用的LH 或CG浓度与现有排卵诱导方案中所用的浓度相比是降低的，因此减少卵巢过度刺激的可能性，最后避免了与此条件相关的副作用多胎出生、新生儿体重低及影响母亲健康的并发症。应当注意，在排卵周期期间给予非多肽cAMP水平调节剂对卵泡成熟和发育没有治疗作用。所以，本发明涉及诱导雌性宿主排卵的方法，包括把非多肽环一磷酸腺苷(cAMP) 水平调节剂给予该雌性宿主。非多肽cAMP水平调节剂的作用直接或间接地增加胞内cAMP 水平。这些化合物通过刺激cAMP合成或抑制其降解，或者通过这二方面作用增加cAMP水平。可增加cAMP合成的调节剂的例子包括腺苷酸环化酶激活剂，例如弗司扣林。可降低 cAMP降解的调节剂的例子包括磷酸二酯酶抑制剂，例如茶碱。优选的非多肽cAMP水平调节剂包括磷酸二酯酶抑制剂，特别是磷酸二酯酶4同种型的抑制剂。本发明另一方面提出在宿主排卵周期的黄体期之前特异性给予非多肽cAMP水平调节剂。作为排卵诱导方案中hCG的增强剂或替代物，在该排卵诱导方案中，hCG通常在排卵周期接近卵泡期结束但在黄体期之前的时间内给予。给予非多肽cAMP水平调节剂的优选时间是宿主排卵周期的黄体期之前。本发明还提出在给予非多肽cAMP水平调节剂诱导排卵之前刺激卵泡发育，包括在宿主排卵周期的卵泡期期间给予能增大FSH浓度的药剂。优选的药剂包括FSH本身、氯米芬、选择性雌激素受体调节剂、芳香酶抑制剂以及不是FSH但有FSH生物功能和活性的试剂。所以，本发明要求保护在指定时间给予本文所述与卵泡生长和成熟有关的药剂，改善排卵过程和随后要怀孕必须进行的受精过程。应当注意，当单独给予非多肽cAMP水平调节剂，以及不与hCG共给予时，本发明提供比现有涉及使用CG的排卵诱导方案更早的妊娠诊断测试机会。V.磷酸二酯酶抑制剂至于磷酸二酯酶抑制剂用作非多肽cAMP水平调节剂，基本上任何一种无毒性的PDE抑制剂都可用在本发明的方法中，包括选择性和非选择性PDE4抑制剂。合适的非选择性PDE4抑制剂和PDE3/PDE4组合抑制剂包括茶碱、异丁基甲基黄嘌呤、 AH-21-132、0rg-30029 (Organon)、0rg-20241 (Organon)、Org-9731 (Organon)、扎达维林 (Zardaverine)、长春西汀(vinpocetine)、EHNA(MEP-I)、咪利酮(Milrinone)、氰胍佐旦(Siguazodan)、扎普司特(Zaprinast)、SK+F 96231、托拉芬群(Tolafentrine) (Byk Gulden)、非明司特(Filaminast) (Wyeth-Ayerst 药厂)。特别优选的是对PDE4有特异性的选择性抑制剂。许多公知的选择性PDE4抑制剂属于六种化学结构之一类咯利普兰(rolipram-like)、黄嘌呤、硝喹宗(nitraquazones)、 苯并呋喃、萘和喹啉。类咯利普兰类似物的例子包括咯利普兰的咪唑烷酮和吡咯烷酮类似物，例如Ro 20-1724以及咯利普兰的苯甲酰胺衍生物，例如RP 73401 (Rhone-Poulenc Rorer药厂)。黄嘌呤类似物包括登布茶碱(Denbufylline) (SmithKline Beecham药厂) 和阿罗茶碱(Arofylline) (Almirall药厂)；硝喹宗类似物包括CP-77，059 (Pf izer)及一系列吡啶[2，3d]哒嗪-5-酮(Syntex)；苯并呋喃类似物包括EP-685479 (Bayer)；萘类似物
12包括 T-440 (Tanabe Seiyaku)；喹啉类似物包括 SDZ-ISQ-844 (Novartis)。更优选的是下列化合物WO 97/42174 (Pfizer, Inc.)公开的化合物


本发明涉及诱导雌性宿主排卵的方法，所述方法包括把非多肽环一磷酸腺苷(cAMP)水平调节剂给予该雌性宿主。本发明另一方面提出在宿主排卵周期的黄体期之前特异性给予磷酸二酯酶抑制剂。优选的非多肽cAMP水平调节剂包括磷酸二酯酶抑制剂，特别是磷酸二酯酶4同种型的抑制剂。