专利名称：无指盘臭蛙丙精肽、基因和变异体及其在制药中的应用的制作方法丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor，serpin)的最基本的功能是防止蛋白质水解，调节丝氨酸蛋白酶的水解平衡。通过对丝氨酸蛋白酶的调节，丝氨酸蛋白酶抑制剂对生物体内的许多重要的生理生化功能都有重要的影响。以下14类生理生化功能都受丝氨酸蛋白酶抑制剂的调节血液凝固、补体形成、纤溶、蛋白质折叠、细胞迁移、细胞分化、细胞基质重建、激素形成及转运、细胞内蛋白质水解、血压调节、肿瘤抑制以及病毒或寄生虫致病性的形成。由于如此众多的生理功能受其的调节，丝氨酸蛋白酶抑制剂已成为国际研究的热点。而其研究与开发则蕴含着巨大的临床治疗药物制备价值。肿瘤是危害人类健康的一类主要疾病，而且治疗药物匮乏。据报道，恶性肿瘤仅在我国每年就新增加160万病例，而且患病年龄逐渐年轻化。目前在化疗中所使用的药物，如阿霉素、环磷酰胺、肿瘤坏死因子等均具有较大的人体毒性，副作用非常的大，因而肿瘤治疗药物的开发是药物研制的热点。肿瘤扩张和转移是目前临床治疗肿瘤效率低下的重要原因之一。丝氨酸蛋白酶抑制剂maspin在体内和体外对肿瘤都有明显的抑制作用，其作用机理在于抑制肿瘤细胞浸润和血管形成。据国内外文献报道，丝氨酸蛋白酶抑制剂如aprotinin除已在临床上广泛用于胃炎、胰腺炎等疾病的治疗外，也在胸外科手术中用于抗纤溶，抑制接触性激活、抗炎症等。丝氨酸蛋白酶类似物如Kallikrein，tryptase在风湿性关节炎以及许多炎症中(如鼻炎、结膜炎、哮喘、胃肠炎、心血管系统炎症)发生中起着重要的作用。临床试验证明其抑制剂是有效的治疗药物。另一方面，目前临床上还没有有效地治疗疱疹病毒感染的药物，近年来发现抑制疱疹病毒丝氨酸蛋白酶是有效的治疗手段。上述这些新的丝氨酸蛋白酶抑制剂药物已处于II，III期临床阶段和已经商品化。在中国的传统中药和民族医药中，许多两栖类动物被作为药材而被广泛的应用，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼铃蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylaranaguentheri)和泽蛙(Euphlyctislimnocharis)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效，已报道药理活性有广谱抗菌作用、抗肿瘤、局部麻醉、镇痛、免疫调节、对心血管系统的作用等，另一方面，传统中药药物成分的复杂性及其炮制方法的局限性也是造成药物活性成分不能更好发挥作用的重要原因，因而从这些传统药物中寻找特定的活性单体化合物是中药现代化的重要内容之一。在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已经成为新药发明的热点。国外学者已从东方铃蟾中分离出一低分子量具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的多肽BSTI，而国内学者从大蹼铃蟾中分离到了具有丝氨酸蛋白酶抑制作用的多肽BMTI。从蟾蜍和林蛙皮肤中得到了具有舒张血管和降压作用的bufokinin和ranakinin。从北美豹蛙和阿伯蛙中分离到了具有免疫调节和抗肿瘤作用的亮精肽和酪精肽。近十几年对170多种两栖类皮肤活性肽和类似物进行了筛选，证明有40多种活性肽有较好的药物开发前景。我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要集中于生物碱等有机小分子，对其皮肤活性蛋白肽类物质的研究还较少。无指盘臭蛙主要分布于我国的云南，四川和广西等省，是我国的特色资源动物之一。而目前关于无指盘臭蛙皮肤活性物质的研究还鲜有报道。发明人将本发明的无指盘臭蛙丙精肽及其变异体全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。发明人将本发明的无指盘臭蛙丙精肽编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。
本发明的目的是基于上述现有技术基础，提供一组具有强烈的丝氨酸蛋白酶抑制剂活性，同时具有较强的肿瘤细胞生长抑制活性和免疫调节活性的无指盘臭蛙指盘臭蛙丙精肽、其基因和各种变异体在制药中的应用。
为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案无指盘臭蛙丙精肽无指盘臭蛙丙精肽是中国两栖类动物无指盘臭蛙基因编码的一种环状多肽，分子量2188.68道尔顿，等电点10.07，具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性.无酶活性，无指盘臭蛙丙精肽全序列为Ala1-Ala2-Leu3-Lys4-Gly5-Cys6-Trp7-Thr8-Lys9-Ser10-Ile11-Pro12-Pro13-Lys14-Pro15-Cys16-Phe17-Gly18-Lys19-Arg20，其第6位的半胱氨酸和第16位的半胱氨酸形成分子内二硫键。
无指盘臭蛙丙精肽基因的克隆包括无指盘臭蛙皮肤总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选无指盘臭蛙蛋白酶抑制剂基因。扩增引物长度为23个核苷酸，其序列为5’ATGTTCACCATGAAGAAATCCCT 3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司SMARTTMcDNA Library Construction Kit中的3’PCR Primer引物，其序列为5′ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3′。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码无指盘臭蛙丙精肽的基因由304个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为atgttcacct tgaagaaatc cctgttactc cttttctttc ttgggatcat ctccttatct60ttccgtgagc aagagagaga tgccgatgaa gatgatggag gggaagttac aggggaagaa120
gtaaaaagag ctgcactcaa agggtgctgg accaagagta taccaccaaa gccttgtttt180ggaaaaagat aaaacttgaa atggaaatca tctgatgtgg aatatcattt agctaaatgc240taaatgtctg ataaaaaata aaatatattg cacgtacaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa300aaaa 304编码成熟无指盘臭蛙丙精肽序列的为第130-189位核苷酸，其氨基酸序列为Ala Ala Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly Lys Arg1 5 10 15 20利用蛋白组学方法设计无指盘臭蛙丙精肽的变异体，其变异体如下丙精肽2，第1位和第2位的丙氨酸同时缺失Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly Lys Arg丙精肽3，第1位的丙氨酸和第20位的精氨酸同时缺失Ala Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly Lys丙精肽4，第1、2的丙氨酸和第20位的精氨酸同时缺失Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly Lys丙精肽5，第1、2的丙氨酸、第19位的赖氨酸和第20位的精氨酸同时缺失Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly。
无指盘臭蛙丙精肽及其变异体的制备方法根据编码无指盘臭蛙丙精肽的基因推断无指盘臭蛙丙精肽的氨基酸序列，利用蛋白组学方法设计无指盘臭蛙丙精肽的突变体，用自动多肽合成仪合成其全序列。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。然后用HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment mass spectrometry，FAB-MS)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
本发明的无指盘臭蛙丙精肽、基因和变异体作为制备治疗肿瘤、胃炎、胰腺炎药物的应用。
本发明的有益效果在于由无指盘臭蛙丙精肽编码基因推导其氨基酸结构，利用蛋白组学方法设计无指盘臭蛙丙精肽的突变体，合成的无指盘臭蛙丙精肽及其突变体具有显著的免疫调节和抑制肿瘤生长的作用。该无指盘臭蛙丙精肽及其突变体具有结构简单、人工合成方便、抑制肿瘤效果明显的有益特点。

无指盘臭蛙丙精肽基因克隆I、无指盘臭蛙皮肤总RNA提取
A.活体无指盘臭蛙用水清洗干净，放入液氮中速冻4小时，取皮肤组织，称重，取300mg皮肤组织，加入10ml总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBCOBRL公司产品)，于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟。
B.加入等体积酚/氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。
C.上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为无指盘臭蛙皮肤总RNA。
II、无指盘臭蛙皮肤mRNA的纯化无指盘臭蛙皮肤mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的PolyATtract?mRNAIsolation Systems试剂盒。
A.取无指盘臭蛙皮肤总RNA 500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分钟，加人3μl的Oligo(dT)探针和13μl 20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。
B.磁珠(SA-PMP)的洗涤将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC悬浮，称之为B液。
C.将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.1ml DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15ml DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的无指盘臭蛙皮肤mRNA。
D.加入1/10体积3M乙酸钠，pH5.2，等体积异丙醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。
III、无指盘臭蛙皮肤cDNA文库构建采用CLONTECH公司CreatorTMSMARTTMcDNALibrary Construction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒。
A.cDNA第一链合成(mRNA反转录)1.在0.5ml无菌的离心管加入1μl无指盘臭蛙皮肤mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3’PCR引物，加2μl去离子水使总体积达到5μl。
2.混匀离心管中的试剂并短暂离心，72℃保温2分钟。
3.将离心管在冰上孵育2分钟。
4.在离心管中加入以下试剂2.0μ15×第一链缓冲、1.0μl 20mM二硫苏糖醇、1.0μl 10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反转录酶。
5.混合离心管中试剂并短暂离心，在42℃保温1小时。
6.将离心管置于冰上中止第一链的合成。
7.从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。
B.采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链
1.95℃预热PCR仪。
2.将2μl cDNA第一链(mRNA反转录)、80μl去离子水、10μl 10×Advantage2PCR缓冲、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。
3.在PCR仪中按以下程序扩增①95℃20秒钟②22个循环95℃5秒钟68℃6分钟4.循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链进行抽提。
C.PCR产物用PROMEGA公司的Wizard?SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒进行抽提回收，步骤如下1.将通过PCR得到的cDNA双链加入等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合。16,000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
2.加入700μl的洗脱液(含乙醇)于离心纯化柱中，16,000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
3.重复步骤2。
4.16,000g离心5分钟。
5.将离心纯化柱置于新的离心管中。
6.加入30μl超纯水，在室温下静置5分钟。
7.16,000g离心1分钟，管底溶液即为所纯化过的cDNA双链。
D.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备1.挑取单个DH5α菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接种于50ml LB培养液中，37℃振荡2小时。当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。
2.将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上方置10min，使培养物冷却至0℃。
3.于4℃以4100r/min离心10min，以回收细胞。
4.倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。
5.每50ml初始培养液且30ml预冷的0.1mol/L CaCl2-MgCl2溶液(80mmol/LMgCl2，20mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6.于4℃以4100r/min离心10min，以回收细胞。
7.倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。
8.每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份细胞沉淀，分装后备用。
E.酶切、连接以及连接产物的转化1.在微量离心管中加入1μl Takara pMD18-T载体、4μl无指盘臭蛙cDNA双链溶液，全量为5μl。
2.加入5μl(等量)的连接酶缓冲混合物。
3.16℃反应2小时。
4.全量(10μl)加入至100μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟。
5.42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟。
6.加入37℃温浴过的LB培养基890μl，37℃缓慢振荡培养60分钟。
7.取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培养基上37℃培养16小时，形成单菌落。
8.每个LB平皿用5ml LB液体培养基洗涤菌落，加30％甘油冻存。构建的cDNA大约含1×106个单独克隆。
IV、无指盘臭蛙丙精肽基因克隆筛选扩增引物长度为23个核苷酸，其序列为5’ATGTTCACCATGAAGAAATCCCT 3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司SMARTTMcDNA Library Construction Kit中的3’PCRPrimer引物，其序列为5′ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3′。
PCR反应在如下条件下进行94℃ 30秒钟，60℃ 30秒钟和72℃ 45秒钟，35个循环。
首先滴定构建的细菌cDNA文库，然后用含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基稀释至适当的细菌浓度(大约5000个细菌/毫升，和30个细菌/毫升分别用于首轮筛选第二轮筛选)，在96孔培养板上按8×8矩阵铺板(共64孔，每孔100μl)，37℃过夜培养。按行、列分别合并细菌培养液，有16个样品进行PCR鉴定，交叉阳性孔细菌样品进入第二轮筛选。
V、无指盘臭蛙丙精肽基因序列测定和结果提取质粒DNA用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国AppliedBiosystems373A全自动核苷酸序列测定仪，测序引物为BcaBESTTMSequencing PrimerRV-M和BcaBESTTMSequencing Primer M13-47，BcaBESTTMSequencing Primer RV-M序列5`GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’，BcaBESTTMSequencing Primer M13-475’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’。基因测序结果自5’端至3’端序列为atgttcacct tgaagaaatc cctgttactc cttttctttc ttgggatcat ctccttatct60ttccgtgagc aagagagaga tgccgatgaa gatgatggag gggaagttac aggggaagaa120gtaaaaagag ctgcactcaa agggtgctgg accaagagta taccaccaaa gccttgtttt180ggaaaaagat aaaacttgaa atggaaatca tctgatgtgg aatatcattt agctaaatgc240taaatgtctg ataaaaaata aaatatattg cacgtacaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa300aaaa 304
无指盘臭蛙丙精肽基因核苷酸的序列表为序列长度为304个碱基，序列类型核酸，链数单链，拓扑学直链状，序列种类cDNA，来源无指盘臭蛙皮肤。
编码成熟无指盘臭蛙丙精肽氨基酸序列的为第130-189位核苷酸，其氨基酸序列为Ala Ala Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly Lys Arg1 5 10 15 20无指盘臭蛙丙精肽基因作为基因工程制备无指盘臭蛙丙精肽的应用。
无指盘臭蛙丙精肽变异体作为蛋白质工程制备指盘臭蛙丙精肽变异体的应用。
制备无指盘臭蛙丙精肽及其变异体I、无指盘臭蛙丙精肽的制备方法根据编码无指盘臭蛙丙精肽的基因推断无指盘臭蛙丙精肽的氨基酸序列，利用蛋白组学方法设计无指盘臭蛙丙精肽的突变体，用自动多肽合成仪合成其全序列。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。
II、分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment mass spectrometry，FAB-MS)，以甘油∶间硝基苄醇∶二甲亚砜(1∶1∶1，V∶V∶V，体积比)为底物，Cs+作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Kv。
III、纯化的无指盘臭蛙丙精肽及其变异体用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
无指盘臭蛙丙精肽是中国两栖类动物无指盘臭蛙基因编码的一种环状多肽，分子量2188.68道尔顿，等电点10.07，具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性.无酶活性，无指盘臭蛙丙精肽全序列为Ala1-Ala2-Leu3-Lys4-Gly5-Cys6-Trp7-Thr8-Lys9-Ser10-Ile11-Pro12-Pro13-Lys14-Pro15-Cys16-Phe17-Gly18-Lys19-Arg20，其第6位的半胱氨酸和第16位的半胱氨酸形成分子内二硫键。
无指盘臭蛙丙精肽变异体是通过蛋白组学的方法设计的一组具有改良的丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的环状多肽.无酶活性，它们的全序列如下丙精肽2，Leu-Lys-Gly-Cys-Trp-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Lys-Pro-Cys-Phe-Gly-Lys-Arg丙精肽3，Ala-Leu-Lys-Gly-Cys-Trp-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Lys-Pro-Cys-Phe-Gly-Lys丙精肽4，Leu-Lys-Gly-Cys-Trp-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Lys-Pro-Cys-Phe-Gly-Lys丙精肽5，Leu-Lys-Gly-Cys-Trp-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Lys-Pro-Cys-Phe-Gly
无指盘臭蛙抗菌肽的药理实验1.无指盘臭蛙丙精肽及其变异体抑制丝氨酸蛋白酶的作用不同量的无指盘臭蛙丙精肽及其变异体溶解于0.05M Tris-HCl缓冲液与一定量的胰蛋白酶(最终浓度为40μg/ml)于0.05M Tris-HCl缓冲液于室温下保温2min，最后加入发色底物S-2238(终浓度为40μg/ml)启动反应，应用PERKIN ELMER(美国)公司生产的分光光度计于处监测吸收值变化2min，加入同样体积的0.05M Tris-HCl缓冲液与空白对照，抑制常数Ki＝[I]/(V0/VI+1)计算。[I]为无指盘臭蛙丙精肽及其变异体的摩尔浓度，V0为空白对照是胰蛋白酶与发色底物的反应速度，V1为加入无指盘臭蛙丙精肽及其变异体后胰蛋白酶与发色底物的反应速度。此试验重复六次，取平均值。
无指盘丙精肽及其变异体均能很有效地抑制胰蛋白酶的活性，在上述试验条件下抑制半数胰蛋白酶活性所需要的无指盘臭蛙丙精肽及其变异体浓度及其抑制常数Ki见表1。
表1 无指盘臭蛙丙精肽及其变异体对丝氨酸蛋白酶的抑制作用

2.无指盘臭蛙丙精肽及其变异体抑制肿瘤生长的作用在96孔细胞培养板上，将待测样品用完全培养基进行5倍或2倍倍比稀释，共六个稀释度，每个稀释度设3个重复孔，每孔100μl，同时设置正常细胞对照。每孔滴加3×105个/ml的HepG2、C8166和Molt-4细胞100μl。置37℃，5％CO2培养箱内培养。48小时后用MTT法测定待测化合物对细胞的毒性作用。EC50是对50％宿主细胞产生细胞毒性作用时的浓度。
表1 无指盘臭蛙丙精肽及其变异体抑制肿瘤细胞生长的作用

由表1可见，无指盘臭蛙丙精肽及其变异体能显著抑制肝肿瘤细胞系(HepG2)和两种淋巴细胞系(C8166和Molt-4)的生长，这表明无指盘臭蛙丙精肽及其变异体具有很强的抑制肿瘤细胞生长和调节免役的作用，并表现出改良的性能，同时还具有序列简单、合成方便等优点。可作为制备治疗肿瘤、胃炎、胰腺炎药物的应用。
无指盘臭蛙丙精肽、基因和变异体及其在制药中的应用.seqSEQUENCE LISTING<110>中国科学院昆明动物研究所<120>无指盘臭蛙丙精肽、基因和变异体及其在制药中的应用<130>1<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>304<212>DNA<213>Rana grahami<400>1atgttcacct tgaagaaatc cctgttactc cttttctttc ttgggatcat ctccttatct60ttccgtgagc aagagagaga tgccgatgaa gatgatggag gggaagttac aggggaagaa120gtaaaaagag ctgcactcaa agggtgctgg accaagagta taccaccaaa gccttgtttt180ggaaaaagat aaaacttgaa atggaaatca tctgatgtgg aatatcattt agctaaatgc240taaatgtctg ataaaaaata aaatatattg cacgtacaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa300aaaa 304<210>2<211>20<212>PRT<213>Rana grahami<400>2Ala Ala Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys1 5 10 15Phe Gly Lys Arg20


本发明涉及无指盘臭蛙丙精肽、基因和变异体及其在制药中的应用，属生物医学技术领域。无指盘臭蛙丙精肽是一种环状多肽，分子量2188.68道尔顿，等电点10.07，具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性.无酶活性，无指盘臭蛙丙精肽全序列为NH