专利名称：一种快速定量检测植物乳杆菌st-ⅲ的方法及其试剂盒的制作方法益生菌是“当摄入一定数量后，能对宿主健康起有益作用的微生物活体”。随着生物技术及医学等学科的发展，益生菌对人体健康的有益功效越来越多地得到证实，益生菌制品也因此日益受到人们的追捧，生产及销售量也逐年呈上升趋势。大量研究表明，只有产品中益生菌的活菌数达到IX IO6个/ML才能够发挥其应有的功效。然而由于我国尚没有系统地研究和制定益生菌制品的标准，特别是市场上对所含益生菌活菌数以及在货架期益生菌存活数没有进行严格限定，导致益生菌及制品市场异常混乱，甚至出现在益生菌制品中检验不出该益生菌的以假乱真现象。如此以来，对其质量的监督管理，尤其对其所含益生菌的种类及其数量的检测就显得尤为重要。传统方法中对益生菌的定性、定量检测，仍采用生理生化反应和选择性培养基纯培养分离计数的方法。这些方法易受培养条件、菌种特性等因素影响，检测效率有限，特别是很难区分同种的不同的细菌，使得在含有多种细菌的复杂体系中很难检测到目标益生菌的实际数量。随着科技的进步，以PCR为基础分子生物学方法以其较高的准确性及稳定性等优点已成功介入到益生菌的鉴定领域。特别是实时荧光定量PCR(Real-time PCR)的出现更是实现了 PCR技术从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，成为了分子生物学和微生物学领域定量检测的重要方法。采用实时荧光定量PCR技术建立简便、快速、准确的益生菌乳制品中益生菌定量检测方法，可以简化益生菌的检测程序、提高检测效率，能提高我国益生菌的定量检测能力、完善保健食品的质量监管，并为益生菌产业的长远发展提供技术保障。植物乳杆菌ST-III是一种从是从泡菜中分离得到的具有降胆固醇、降血脂、粘附肠道上皮细胞等多种功能的益生菌。该菌株已作为生产发酵剂在光明乳业有限公司正式投产上市，市场反映良好。为了更好地发挥ST-III的益生功能，就必须要保证产品活菌数达到IX IO6个/ML，这就需要测定ST-III在益生菌产品中的实际数量。因此建立一种快速、 简便、特异地检测产品中ST-III实际数量的方法对于实际生产和应用有重要意义。
本发明所要解决的技术问题是针对目前尚不存在植物乳杆菌ST-III菌株分子检测手段的现状，提供一种快速、特异性强、灵敏度高、成本低的定量检测植物乳杆菌ST-III 的方法及其试剂盒。本发明采取的技术方案之一为一种快速定量检测植物乳杆菌ST-III的方法，包括以下步骤1)提取待检样品的总RNA ；32)将步骤1)提取的总RNA反转录成cDNA ；3)采用特异性扩增植物乳杆菌ST-III的引物对，以步骤2)所得cDNA为模板，进行荧光定量PCR扩增检测；4)通过比较待检样品和定量外标准品的循环阈值而对待检样品中的实际拷贝数进行定量。本发明步骤；3)所述的引物对中，一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列相同，引物长度为15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是23bp ；另一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列互补，引物长度为15-40bp，更佳的是 20-30bp，最佳的是27bp ；该引物对的扩增片段为200-867bp，优选M2bp ；所述的植物乳杆菌ST-III遗传标记分子是编码植物乳杆菌ST-III KilA结构域蛋白的基因；优选的是编码植物乳杆菌ST-III的KilA结构域蛋白基因的第1位至第867位所示序列的核苷酸中连续的200-867个，优选242个核苷酸片段；更优选的，是编码植物乳杆菌ST-III的KilA结构域蛋白基因的第360位至第601位所示序列的核苷酸；最优选的其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第360位至第601位所示。最优选的，所述的引物对中，一条引物的序列如SEQ ID NO. 2所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO. 3所示。本发明步骤3)所述的PCR反应体系为常规，只要能够扩增出特异性产物即可。PCR 反应体系优选包括上游引物，下游引物，dNTP, PCR buffer, Mg2+，Taq DNA聚合酶，cDNA模板和SYBR Green I。其中，上游引物或者下游引物优选的终浓度为0. 1-Ι.ΟμΜ，更优选 0. 2 μ M ；cDNA模板的终浓度优选为0. 5-2ng/ μ L，更优选的lng/ μ L。而其他组分的浓度如常规，一般是 0. 2mmol/L dNTP, IXPCR buffer, 1. Ommol/L Mg2+，0. 02U/μ L Taq DNA 聚合酶。步骤3)所述的PCR反应参数为常规，只要能够扩增出特异性产物即可。较佳的为 950C 30S ；950C 5S,60°C 25S，72°C 30S,40 个循环；4°C保存。本发明步骤4)所述的定量外标准品优选植物乳杆菌ST-III的总RNA反转录后的总cDNA。优选的，采用定量外标准品的10倍梯度水稀释液，稀释度从IO-1UO-2UO-3UO^ 10_5、10_6、ΙΟ"7, ΙΟ"8,进行在荧光定量PCR，根据梯度稀释的定量标准品的不同Ct值定量待检样品中的cDNA分子数量。本发明采取的技术方案之二为一种检测植物乳杆菌ST-III的荧光定量PCR试剂盒，包括特异性扩增植物乳杆菌ST-III遗传标记分子的的引物对。该引物对中，一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列相同，引物长度为15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是23bp ；另一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列互补，引物长度为15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是27bp ；该引物对的扩增片段为 200-867bp，优选M2bp ；所述的植物乳杆菌ST-III遗传标记分子是编码植物乳杆菌ST-III KilA结构域蛋白的基因；优选的是编码植物乳杆菌ST-III的KilA结构域蛋白基因的第1 位至第867位所示序列的核苷酸中连续的200-867个，优选242个核苷酸片段；更优选的， 是编码植物乳杆菌ST-III的KilA结构域蛋白基因的第360位至第601位所示序列的核苷酸；最优选的其核苷酸序列如SEQ IDN0. 1的第360位至第601位所示。最优选的，所述的引物对中，一条引物的序列如SEQ ID N0. 2所示，另一条引物的序列如SEQ ID N0. 3所示。本发明所述的检测植物乳杆菌ST-III的荧光定量PCR试剂盒，还包括STOR Green I荧光定量检测试剂。本发明所述STOR Green I荧光定量检测试剂一较佳方式含有荧光定量反应液，其中包括STOR Green I荧光染料、PCR缓冲液、dNTPs溶液、TaqDNA聚合酶、无菌双蒸水、MgCl2 溶液等组分，使用时只需加入引物和模板即可进行PCR反应。本发明所述STOR Green I荧光定量检测试剂另一较佳方式含有荧光定量总反应液，其中包含了 STOR Green I荧光染料、引物、PCR缓冲液、dNIPs溶液、Taq DNA聚合酶、无菌双蒸水、MgCl2溶液等所有组份，使用时只需加入模板即可进行PCR反应，操作非常快捷简单。本发明所述的检测植物乳杆菌ST-III的荧光定量PCR试剂盒，还包括定量外标准品。所述的定量外标准品是植物乳杆菌ST-III的总RNA反转录后的总CDNA。本发明所述的检测植物乳杆菌ST-III的荧光定量PCR试剂盒，还包括RNA提取试剂和/或反转录试剂。所述的RNA提取试剂较佳的含有Trizol、RNA酶抑制剂。所述的反转录试剂较佳的含有逆转录酶(AMV)、AMV缓冲液。AMV缓冲液含有dNTPs、随机引物、RNA 酶抑制剂、无菌双蒸水。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。本发明中，植物乳杆菌ST-III是现有技术，为CGMCC No. 0847。本发明提供了一种快速检测植物乳杆菌ST-III菌株数量的方法及试剂盒，具有如下优点1、检测速度快、特异性强对于微生物的普通生化鉴定一般需要2-3天，PCR鉴定只需要2_3小时；且普通生化鉴定无法鉴定同种植物乳杆菌之间的不同菌株，本发明设计的PCR引物对根据编码植物乳杆菌ST-III菌株的KilA结构域蛋白基因的特异性标志片段设计，该引物对可以在植物乳杆菌ST-III菌株中扩增出相应的DNA片段，并且只特异性的扩增植物乳杆菌ST-III的基因，而不能在其他相关植物乳杆菌中扩增出相应片段，包括NCBI已报道的经过全基因组测序的三种植物乳杆菌菌株，说明以该基因片段为基础设计的PCR反应系统具有良好的特异性。2、灵敏度高、成本低荧光定量PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克级的起始待测模板扩增到微克水平，即使待测样品中只含有3个目标细菌，PCR也可以检出，因此灵敏度高。本发明检测限达到2. 85xl03CFU/mLo普通生化鉴定方法所用试剂种类多，步骤复杂，而PCR鉴定试剂种类少，操作简单，成本较低。此外，与通过全基因组序列测序区分同类细菌间不同菌株的方法相比，费用大为降低、实验周期也大为缩短，可以很方便地投入实际应用。3、本发明的独特之处在于，特异引物的设计使得该方法只对ST-III的特征片段进行扩增，排除了其他细菌特别是其他植物乳杆菌的干扰；以RNA为基础的荧光定量PCR可以排除已死亡的ST-III，只检测产品的活菌数量。

以下结合

本发明的特征和有益效果。图1是植物乳杆菌的荧光定量PCR标准曲线。

进行定量。本发明的待测样品为任何可能含有植物乳杆菌ST-III菌株的物质，较佳的比如益生菌类发酵乳制品，包括酸奶，也包括发酵豆奶等。本发明中，步骤1)提取待检样品的总RNA的方法是常规技术，如Trizol提取法， 为本领域技术人员所熟知。本发明中，步骤2)将总RNA反转录成cDNA的方法也是常规技术，一般用反转录酶进行反应，一般在PCR仪上在反转录酶适宜的温度下反应一段时间即可，这也是为本领域技术人员所熟悉的方法。本发明中，步骤3)采用本发明的特异性引物进行荧光定量PCR扩增，较佳的在实时荧光PCR仪中进行。所用的引物为本发明所特别提供的特异性扩增植物乳杆菌ST-III遗传标记分子的的引物对。该引物对中，一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列相同，引物长度为15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是23bp ；另一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列互补，引物长度为15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是27bp。该引物对的扩增片段为200-867bp，优选M2bp。所述的植物乳杆菌ST-III遗传标记分子是编码植物乳杆菌ST-III KilA结构域蛋白的基因；优选的是编码植物乳杆菌 ST-III的KilA结构域蛋白基因的第1位至第867位所示序列的核苷酸中连续的200-867 个，优选242个核苷酸片段；更优选的，是编码植物乳杆菌ST-III的KilA结构域蛋白基因的第360位至第601位所示序列的核苷酸；最优选的其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第360 位至第601位所示。最优选的，所述的引物对中，一条引物的序列如SEQ IDN0.2所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO. 3所示。它们的扩增片段长度为M2bp。其中，所述的PCR反应体系为常规，只要能够扩增出特异性产物即可。PCR反应体系优选包括上游引物，下游引物，dNTP, PCR buffer, Mg2+，TaqDNA聚合酶，cDNA模板和 SYBR Green I。其中，上游引物或者下游引物的终浓度为0. 1-1. 0 μ M，优选0. 2 μ M ； cDNA模板的终浓度为0. 5-2ng/yL，优选的Ing/μ L。而其他组分的浓度如常规，一般是 0. 2mmol/L dNTP, 1 XPCRbuffer, 1. Ommo 1/L Mg2+，0. 02U/μ L Taq DNA 聚合酶。步骤 3)所述的PCR反应参数为常规，只要能够扩增出特异性产物即可。较佳的为95°C 30S ；95°C 5S， 60°C 25S，72°C 30S,40 个循环；4°C保存。步骤4)通过比较待检样品和定量外标准品的循环阈值而对待检样品中的实际拷贝数进行定量。所述的定量外标准品是植物乳杆菌ST-III的总RNA反转录后的总cDNA。采用定量外标准品的10倍梯度水稀释液，稀释度从IO-1UO^ 10_3、10_4、10_5、10_6、IO-7, IO-8, 进行在荧光定量PCR，由于每个稀释度中CDNA分子不同，得到的Ct值就不同，根据梯度稀释的定量标准品的不同Ct值定量待检样品中的cDNA分子数量如拷贝数。荧光定量PCR试剂盒本试剂盒采用了 STOR Green I嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂，可快速对目的基因进行定量检测。在一优选例中，本发明提供快速检测植物乳杆菌ST-III的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括特异性扩增植物乳杆菌ST-III遗传标记分子的引物对。 该引物对中，一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列相同，引物长度为 15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是23bp ；另一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列互补，引物长度为15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是27bp。该引物对的扩增片段为200-867bp，优选M2bp。所述的植物乳杆菌ST-III遗传标记分子是编码植物乳杆菌ST-III KilA结构域蛋白的基因；优选的是编码植物乳杆菌ST-III的KilA结构域蛋白基因的第1位至第867位所示序列的核苷酸中连续的200-867个，优选242个核苷酸片段；更优选的，是编码植物乳杆菌ST-III的KilA结构域蛋白基因的第360位至第601 位所示序列的核苷酸；最优选的其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第360位至第601位所示。 最优选的，所述的引物对中，一条引物的序列如SEQ ID NO. 2所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO. 3 所示。 在另一优选例中，本发明的快速定量检测植物乳杆菌ST-III的荧光定量PCR试剂盒包括STOR Green I荧光定量检测试剂。所述STOR Green I荧光定量检测试剂的一较佳方式是含有荧光定量反应液，其中包括STOR Green I荧光染料、PCR缓冲液、dNTPs溶液、 Taq DNA聚合酶、无菌双蒸水、MgCl2溶液等组分，使用时只需加入引物和模板即可进行PCR 反应。所述STORGreen I荧光定量检测试剂的另一较佳方式是含有荧光定量总反应液，其中包含了 STOR Green I荧光染料、引物、PCR缓冲液、dNTPs溶液、Taq DNA聚合酶、无菌双蒸水、MgCl2溶液等所有组份，使用时只需加入模板即可进行PCR反应，操作非常快捷简单。荧光可以被定量PCR仪内的荧光信号采集系统检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量成正比例关系。对植物乳杆菌ST-III的定量可以通过与定量标准品的循环阈值 (Ct, Threshold Cycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环数。Ct值与起始模板数成一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多；相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用梯度稀释标准品的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可以准确测出该样品的起始拷贝数。本发明提供的快速定量检测植物乳杆菌ST-III的荧光定量PCR试剂盒较佳的还包括定量外标准品。所述的定量外标准品是植物乳杆菌ST-III的总RNA经过测量^Onm的吸光度计算得到其实际的拷贝数，后反转录后的总cDNA，定量时采用10倍梯度水稀释液， 稀释度从κγ^ΙΟΛΙΟΛΙΟΛΙΟΛΙΟΛΚΓ^ΙΟΛ在荧光定量PCR中，由于每个稀释度中 cDNA分子不同，得到的Ct值就不同，根据定量标准品(梯度稀释的定量外标准品)Ct值定量样品中的cDNA分子。本试剂盒较佳的还包括常规的两步法RT-PCR SYBR Green I荧光定量检测试剂盒所包含的成分，如可以包括RNA提取试剂、反转录试剂。其中较佳的RNA提取试剂含有 Trizol、RNA酶抑制剂。反转录试剂含有逆转录酶(AMV)、AMV缓冲液。AMV缓冲液含有dNIPs、随机弓I物、RNA酶抑制剂、无菌双蒸水。本发明的检测植物乳杆菌ST-III的荧光定量PCR试剂盒，通过对各组分，如引物浓度、Mg2+浓度、退火温度等的优化，反复实验，试剂盒完全可以满足快速特异检测植物乳杆菌ST-III的实际需求。下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1益生菌乳制品中植物乳杆菌的定量检测方法a.样品总RNA的制备采用Trizol法提取将市场上购买的含有植物乳杆菌ST-III发酵乳饮料(光明畅优植物乳酸菌饮品)做为实施样品，分别是距离生产日期为19天，15天和13天的三个样品，置于盛有液氮的研钵中研磨，然后迅速加入ImLTrizol试剂，按Trizol试剂盒说明书 (TRIzol Plus RNA Purification System，美国 invitrogen 公司，货号 12183-555)提取样品RNA，然后用DNaseI处理两次，确保完全消除RNA中的DNA污染，得到纯化的RNA样本， 测浓度，RNA完整性通过琼脂糖凝胶电泳检测。b.反转录扩增依据反转录试剂盒(M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit，大连宝生物工程有限公司，货号D6130)说明书进行RNA反转录扩增。c.实时荧光定量PCR荧光定量PCR按照SYBR Prim必cript RT-PCR Kit (大连宝生物工程有限公司，货号 DRR063A)说明书进行。反应体系 25. ομ L :SYBR PremixEx Taq (2X) 12. 5 μ L, 10 μ mol/L 上、下游引物(分别是 SEQ ID NO. 2 和 SEQID N0. 3)各 0. 5 μ L，cDNA 模板 2. O μ L (反应浓度 Ing/ μ L)，CldH2O 9. 5 μ L。荧光定量PCR 反应参数95°C 30S ；95°C 5S，60°C 25S，72°C 30S，40 个循环；4°C保存。d.定量外标准品的制备和标准曲线的绘制提取植物乳杆菌ST-III的总RNA，紫外分光光度计测定吸光度值Q60nm)后，根据 ST-III的基因组大小计算出拷贝数。反转录得到CDNA，做10倍系列稀释，以此作为模版进行如上荧光定量PCR反应。以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数(Ct)为纵坐标得到植物乳杆菌ST-III的标准曲线，见图1。稀释的最低浓度是2. 85xl03CFU/mL，低于此浓度，荧光信号杂乱，因而该方法的检测限为 2. 85xl03CFU/mL。e.结果及判断以待测样品的cDNA为模板，用植物乳杆菌ST-III的菌株特异性引物，以相同的体系进行植物乳杆菌特征片段的荧光定量PCR扩增，结果见表1。依据公式Y = -3. 3691gX+39. 84和待测样品的Ct值，可以计算出样品中植物乳杆菌ST-III的数量，见表1。表1.产品中ST-III含量的定量结果
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本发明公开了一种快速定量检测植物乳杆菌ST-III的方法及其试剂盒。包括以下步骤1)提取待检样品的总RNA；2)将步骤1)提取的总RNA反转录成cDNA；3)采用特异性扩增植物乳杆菌ST-III的引物对，以步骤2)所得cDNA为模板，进行荧光定量PCR扩增检测；4)通过比较待检样品和定量外标准品的循环阈值而对待检样品中的实际拷贝数进行定量。本发明可以快速的检测样品中的植物乳杆菌ST-III数量，快速、特异性强、灵敏度高，检测限达到2.85x103CFU/mL。