专利名称：川芎嗪衍生物在制备治疗肝纤维化药物中的应用的制作方法肝纤维化(Hepatic Fibrosis)是继发于各种形式慢性肝损伤(包括病毒性肝炎， 酗酒，药物作用，代谢性疾病)之后组织修复过程中的代偿反应，也是慢性肝病发展为肝硬化必经的病理过程。肝炎是我国发病率较高的疾病之一，就目前而言我国的肝病状况不容乐观，肝纤维化的发病率持续上升，现已成为我国卫生部门最关心、重视的课题之一。纤维化的实质是肝内细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)合成大于降解导致大量ECM过度沉积。ECM主要来源于肝星状细胞Ofepatic stellate cells，HSC)，又称储脂细胞、Ito细胞、维生素A储存细胞等，是肝脏间质细胞之一，位于肝细胞与窦内皮细胞间的Disse腔内，约占肝脏非实质细胞总数的1/3，与肝窦内皮细胞和肝细胞紧密接触。正常时呈静止状态，不合成或仅合成少量基质，但在肝组织损伤时刺激HSC活化并转变为肌成纤维细胞(Myofibroblasts-like cells，MFB)，收缩迁移表现为细胞增殖。活化的HSC 形态和功能的改变奠定了 HSC在纤维化形成中的关键作用，HSC激活和增生是纤维化发生的中心环节。探讨抑制HSC活化和诱导其凋亡的机制及寻找有效的抗纤维化的药物至关重要，已引起国内外学者越来越多的关注。近年来，国内外学者针对肝纤维化的形成机制，提出了一系列抗肝纤维化治疗药物和方法，如肾上腺皮质素、干扰素等治疗，但疗效不佳。秋水仙在抗肝纤维化方面的疗效得到了肯定，但毒副作用大，不宜长期使用。中药复方及单体药物抗肝纤维化的作用一直是国内外科研及临床研究的重点和热点。目前，我国已出现相关抗肝纤维化的复方，但其均为中药大复方粗制剂，具有服用量大，服用周期长，疗效不确切，治疗机理不明确等缺点。中药单体的研究近年来取得了较大成果，如姜黄素抗肝纤维化的机制已经明确，但胃肠道不易吸收。这就迫使我们需要寻求一种新的易吸收的、适合于临床应用的药物。川芎(ligusticum chuanxiong)，为伞形科蒿木属植物的根茎，性辛、温，辛香行散，温通血脉，功能活血行气，消散淤血，祛风止痛，被前人誉为血中之气药。川芎嗪是由川芎的根茎提取的有效成分，学名为2，3，5，6-四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine，TMP)，为吡嗪类生物碱。分子式=C8H1J2，分子量136. 20，无色针状结晶，熔点80-82°C (显微测定)， 沸点190°C。具有特殊异臭，有吸湿性，易升华。易溶于热水、石油醚，溶于氯仿、稀盐酸，微溶于乙醚，不溶于冷水。川芎嗪有活血化瘀，抗血小板凝聚，扩张小动脉，改善微循环，抗氧化，拮抗钙离子及抗纤维化等作用。近年来，川芎嗪抗组织器官纤维化方面的作用受到关注，其对心肌纤维化、肺纤维化、肾纤维化都有公认的疗效，而且川芎嗪发挥以上抗纤维化作用的机制基本相同。鉴于川芎嗪具有代谢快、半衰期短等不利于临床应用的药代学特点，对川芎嗪代谢产物的活性进行分析，确定川芎嗪抗肝纤维化活性的必须部位和可取代部位，通过构效分析，初步确定川芎嗪的吡嗪环为其药效必须部位，所连接的四个取代基为可修饰基团，因此有目的性和针对性地对川芎嗪侧链进行改造，得到所需要的抗肝纤维化药物，化学名为2，5_ 二羟甲基-3，6-二甲基吡嗪的川芎嗪衍生物。利用川芎嗪衍生物抗肝纤维化的研究，还未见有报道。
发明目的为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种2，5- 二羟甲基_3， 6-二甲基吡嗪在制备抗纤维化疾病中的应用，所述疾病为肝纤维化。技术方案本发明的技术方案是体内研究观察H168对大鼠肝功能的检测及肝纤维化相关指标的测定等。本发明采用大鼠肝纤维化模型及肝星状细胞细胞株HSC-T6，研究H168 在大鼠整体、体外的细胞水平、分子水平上对HSC-T6的增殖、凋亡和相关信号转导通路中关键蛋白表达情况等作用效果，揭示H168抗肝纤维化药物的分子机制，确定其可能的作用靶点，为制备抗肝纤维化药物提供了重要依据。本发明所涉及的抗肝纤维化药物，是H168按照常规的药物制剂工艺制备成一种适合临床上使用的药物制剂，并具备显著的抑制细胞增殖和诱导凋亡的疗效。有益效果所述川芎嗪衍生物代号H168，是伞形科藁本属植物川芎中分离所得的生物碱类化合物川芎嗪的衍生物，其化学名称是2，5_ 二羟甲基-3，6-二甲基吡嗪，分子式为 C8H12N2O2,其结构式如下H3C N CH2OHHOH2C 八 N 八CH3 ι所述的H168主要通过体内观察H168对大鼠肝功能的检测及肝纤维化相关指标的测定；体外对肝星状细胞增殖、凋亡等来研究H168抗肝纤维化作用。实验表明，H168具有优良的抗肝纤维化效果，不管是在整体对大鼠肝纤维化模型，还是抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡都有很强的作用。所述的H168是一种具有抗肝纤维化作用的新化合物，可以用于制备抗肝纤维化药物。图1为H168对HSC-T6增殖的影响；图2为H168对HSC-T6的细胞毒性作用；图3为不同浓度H168对HSC-T6细胞凋亡率的影响；图4为H168对HSC-T6的Bcl_2、Bax和Caspase-3蛋白表达的影响。

Group 生理盐水组
模型组
低剂量组
N 12
9
10 11 11
ALT 40.11±8.12 68.32±11.89** 55.25士 12.73** 51.14±13.45* 46.35±10.12*
5
AST 120.31±28.91 181.25±69.54** 127.81 士 30.15** 127.32±35.76* 115.42±29.15
ALP 243. 69±89.25 312.33±99.15* 300.15士63.65* 279.45±71.15* 271.31±63.45
中剂量组高剂量组
(与正常组相比*P < 0. 05，**P < 0. 01)H168对大鼠纤维化血清指标HA、LN、PCI11的影响HA是一种广泛存在于细胞外基质中的高分子多糖，由肝内间质细胞主要是HSCs 合成，主要由肝窦内皮细胞进行降解。因此，HA可以反映肝脏的损伤程度和纤维化的发展变化。LN是一种大分子非胶原糖蛋白，由肝星状细胞合成后主要分布于基底膜的透明层中。 肝纤维化，肝星状细胞大量合成和分泌胶原、LN等间质成分，形成完整的基底膜。PCIII是 III型前胶原分泌至肝细胞外沉积前，PCIII升高反映的是肝脏纤维增生活跃。(见表二)表二 各组大鼠血清肝纤维化指标HA、LN、PCIII检测结果(χ士 s)


本发明属于制药领域，公开了川芎嗪衍生物(2，5-二羟甲基-3，6-二甲基吡嗪)在制备抗肝纤维化药物中的应用。该川芎嗪衍生物的化学名为2，5-二羟甲基-3，6-二甲基吡嗪，其分子式为C8H12N2O2。本发明研究发现该川芎嗪衍生物从体内和体外实验均表现出良好的抗肝纤维化作用。