专利名称：包含大豆抗毒素作为有效成分的骨疾病治疗用组合物的制作方法包含大豆抗毒素作为有效成分的骨疾病治疗用组合物正常的骨再建过程由骨形成与骨吸收的均衡构成，这种骨形成与骨吸收大体上由三种细胞的相互作用来实现,该三种细胞分别为软骨细胞、成骨细胞(osteoblast)及破骨细胞(osteoclast)。尤其是，成骨细胞的增殖和分化与骨的钙化有密切的关系，如果在成骨细胞中作为重要转录因子的成骨细胞转录因子2 (RUNX2)中发生变异(mutation)或者表达量被减少，则不会引发骨的I丐化。核因子K B受体活化因子配体(RANKL, receptor activator of NF- κ B ligand)在成骨细胞的分化过程中得到表达而成为促进破骨细胞的分化的因子，护骨素(0PG，Osteoprotegerin)也在成骨细胞中得到表达而抑制RANKL的作用，由此成为抑制破骨细胞的分化的因子。骨(bone)用于支撑人体的软组织与体重，并包裹内部器官，来保护内部脏器不受到外部的冲击。并且，骨不仅在结构上支撑肌肉或脏器，还储存体内的钙或其他无机质，即为储存磷或镁等物质的人体重要部分之一。因此，停止成长的成人的骨，不停地活跃并持续地反复除去旧骨，用新骨来代替的生成与吸收过程，来维持均衡，直至人死为止。该过程叫做骨再建(bone remodeling) (Yamaguchi A. et al. , Tanpakushitsu Kakusan Koso. , 50(6Suppl) :664-669 (2005))。除去旧骨并用新骨来代替的骨转换(turnover)用于修复因成长和压力引起的骨的微伤，而且是适当维持骨的功能的必需因素(Cohen-SolalM. etal.,Therapie. , 58 (5) :391-393 (2003))。众所周知，骨再建大体上参与两种细胞。两种细胞之一是生成骨的成骨细胞，另一种是破坏骨的破骨细胞。成骨细胞用于生成NFk B受体活化因子配体及作为其诱导受体(decoy receptor)的护骨素。如果NF κ B受体活化因子配体与位于破骨祖细胞(osteoclast progenitorcells)的表面的作为受体的NF κ B受体活化因子(RANK)相结合，则破骨祖细胞成熟(maturation)为破骨细胞,而引发骨吸收(boneresorption)。但是,如果护骨素与NF κ B受体活化因子配体相结合，则阻断NF κ B受体活化因子配体与NF κ B受体活化因子之间的结合，从而抑制破骨细胞的形成，而且不会引发不必要的骨吸收(TheillLE.et al. , Annu Rev Immunol. , 20:795-823 (2002)；ffagner EF. et al. , Curr Opin GenetDev.， 11:527-532 (2001))。骨质疏松症(osteoporosis)是因多种原因导致骨的质量被减少，并且因骨组织的微小结构的退化而持续增加骨折危险的疾病，一般在构成骨的矿物(尤其是钙)和基质被减少的状态，或者在因骨再建的均衡被破坏而导致破骨作用比成骨作用得到增加的状态下发生(IqbalME ,South Med J. , 93 (I) :2-18 (2000))。虽然正常的骨的内部构成像网一样紧凑的结构，但是在骨质疏松症的情况下，结构之间的间隔变宽，微小结构变薄而脆弱，由此进行到即使受到较小的冲击也容易导致骨折的状态(Stepan JJ. et al. , EndocrRegul. , 37 (4) :225-238 (2003)。骨质疏松症分为以下三种与闭经期开始的同时呈现快速的骨损失(年间29Γ3%)，脊椎的压迫及腕骨容易骨折的危险度增加的闭经期以后的骨质疏松症(Postmenopausal osteoporosis);渐渐发生在70岁以上的男女老人身上(年间O. 5%-1 %),带来髋骨(hipbone)与脊椎骨的逐渐性骨损失的老年期的骨质疏松症(SenileosteopOTosis);以及与年龄无关地因疾病(内分泌疾病、胃肠道疾病及恶性肿瘤)或药物(肾上腺皮质激素、抗癌化学疗法、甲状腺激素、抗惊厥剂、抗凝固剂、甲氨蝶呤(methotrexate)、环孢素(cyclosporine)、促性腺激素释放激素(GnRH)等)、酒精、吸烟、事故引起的第二次骨质疏松症(Secondary osteoporosis) (Rosen CJ. , N Engl J Med. , 353(6) :595-603 (2005) ;Davidson M. , Clinicain Reviews. , 12 (4) :75-82 (2002))。在患有乳房癌(breast cancer)、前列腺癌(prostate cancer)或者多发性骨髓瘤(multiple myeloma)的患者身上几乎经常发生骨转移(Kozlow ff. et al. , JMammary Gland Biol Neoplasia. , 10 (2) : 169-180 (2005)),已知，这些癌患者能够活到多久取决于是否进行骨转移。乳房癌患者或前列腺癌患者的死亡率高的理由在于，癌细胞选择性地转移到骨。已知，在乳房癌中观察到的大部分骨转移是破骨的溶骨性骨转移(osteolytic metastasis),这并不是乳房癌细胞直接影响到骨,而是刺激破骨细胞而 引起的(Boyde A. et al. , ScanElectron Microsc. , 4:1537-1554 (1986))。相反，在前列腺癌中观察到的骨转移是成骨性骨转移(osteoblastic metastasis)。已知，成骨性骨转移还与骨溶解密切相关。转移到骨的多个癌细胞在骨周围的微小环境中增殖而刺激破骨细胞或成骨细胞的活性，由此决定是否进行到溶骨性骨转移还是进行到成骨性骨转移(Choong PF. et al. , ClinOrthop Relat Res.，415S:S19-S31 (2003))。约 80% 的乳房癌患者身上发生癌细胞的骨转移，转移的乳房癌细胞激活破骨细胞(Bendre M. , etal. , Clin Orthop Relat Res. , 415 (Suppl): S39-S45 (2003) ;PalmqvistP. et al. , JImmunol. , 169 (6) :3353-3362 (2002))。被激活的破骨细胞破坏骨周围的微小环境的均衡，来引发骨溶解(osteolysis)，因这种现象，不仅经常发生病性骨折，还引起白细胞减少症(leukoerythroblastic anaemia)、骨畸形、高I丐血症(hypercalcemia)、疼痛(pain)、神经压迫综合征(nervecompression syndromes)等与骨相关的疾病(Roodman GD. , N Engl JMed. , 350:1655-1664 (2004))。众所周知，雌激素的不足现象多见于闭经之后的女性，影响成骨细胞与破骨细胞，导致骨吸收程度比骨形成程度变多，由此成为诱发骨质疏松症的主要因素。因这种原因，为了治疗骨质疏松症，长时间给患者投用如雌激素等激素，但是许多研究认为这将成为乳房癌和子宫内膜癌等的发病原因。目前进行着用于挖掘植物来源的植物雌激素的多项研究，该植物雌激素通过与雌激素受体相结合来起到与雌激素类似的功能，但没有副作用，目前正在踊跃进行着对挖掘出的候选物质对闭经之后因缺乏雌激素而导致的骨质疏松症的预防及治疗效果的相关研究。据报告，作为实例，植物雌激素在骨与心血管系统中呈现雌激素活性，相反，在乳房与子宫中呈现抗雌激素活性。所有植物雌激素是在结构上与雌激素类似的酚类化合物，植物雌激素的代表性物质有异黄酮、木酚素以及酷魔斯坦(cumestran)等。已知，这些植物雌激素的雌激素活性用于防止骨吸收，并维持骨密度。在多项研究中显示，大豆的异黄酮在切除卵巢的小鼠身上有效防止骨减少。为了预防骨质疏松症，民间经常服用红花籽，可见不仅是大豆的异黄酮，而且来源于其他植物的植物雌激素也具有保护骨的效果。作为从大豆中新萃取的植物抗毒素之一的大豆抗毒素(glyceollin)是选择性雌激素受体调节剂(SERM, selective estrogenreceptor modulator),是由大豆苷元所制备的具有抗雌激素效果的物质。最近，踊跃实现借助大豆抗毒素的抗雌激素效果来抑制乳房癌与子宫癌的内容的研究结果。这种研究结果，在能够代替，诱发为了治疗闭经之后女性因缺乏雌激素而导致的骨质疏松症而需要承受的作为危险的副作用的乳房癌与子宫内膜癌的激素的方面上，是十分重要的候选物质。本说明书全文中，参照多篇的论文及专利文献，并表示其引用内容。所引用的论文及专利文献的揭示内容，作为参照全部插入于本说明书中，而将更加明确地说明本发明所属技术领域的水准及本发明的内容。
根据本发明的还有一个实施方式，本发明提供一种用于制备骨疾病的预防或治疗用组合物的大豆抗毒素的用途。根据本发明的又一个实施方式，本发明提供一种包括将包含大豆抗毒素作为有效成分的药剂学组合物投用给骨疾病患者的步骤的骨疾病的预防或治疗方法。本发明者为了开发出能够无副作用且有效地使用于骨疾病的治疗或预防的物质而努力研究。其结果，通过实验已确认，作为一种从豆中萃取的植物抗毒素的大豆抗毒素，在通过动物细胞模型的实验中，抑制由成骨细胞分化为破骨细胞以及活性，并在骨质疏松症引发动物模型中具有治疗骨质疏松症的功效，由此证明有可能开发为对如骨质疏松症等多种骨疾病的治疗有效的活性成分，从而完成了本发明。作为本发明的有效成分的“大豆抗毒素”是大豆发生过敏性反应或者真菌胁迫(fungal stress)期间生成的一种植物抗毒素(phytoalexin)物质。根据本发明的具体的一实施例，上述大豆抗毒素化合物是通过纯化方法，例如通 过层析(chromatography)分离方法，从在浸水的大豆(soybean)处理曲霉(Aspergillussp.)菌株来培养的大豆萃取物中分离及纯化而得的。就上述大豆抗毒素而言，在自然界中，大豆抗毒素I为最主要的形态，作为其两种异构体(isomer)的大豆抗毒素II及大豆抗毒素III微量存在(Clinical Cancer Research2006;12(23)December I, 2006, 7159-7164, Antiestrogenic Glyceollins Suppress HumanBreast andOvarian Carcinoma Tumorigenesis)。在本发明中，活性成分“大豆抗毒素”意味着均包含大豆抗毒素I、大豆抗毒素II、大豆抗毒素III或者这些大豆抗毒素的混合物。根据本发明的优选实例，上述大豆抗毒素是大豆抗毒素I、大豆抗毒素II、大豆抗毒素III，或者这些大豆抗毒素的混合物。根据本发明的更优选的实例，上述大豆抗毒素为大豆抗毒素I。根据本发明的优选实例，本发明的大豆抗毒素抑制破骨细胞的分化。破骨细胞是在血液细胞(造血干细胞)中产生的细胞,具有当血液内缺I丐或者需要进行骨再建时破坏骨的功能。并且，本说明书的术语“骨吸收”意味着破骨细胞向骨分泌较强的酸(acid)及蛋白质降解酶来降解骨。根据本发明的再一个优选实例，本发明的大豆抗毒素在成骨细胞或者前成骨细胞(preosteoblast)中促进成骨细胞转录因子2蛋白质的降解。根据本发明的另一个优选实例，本发明的大豆抗毒素具有在成骨细胞中抑制NFkB受体活化因子配体的信使核糖核酸(mRNA)表达水准来抑制破骨细胞的分化的功效。结果，本发明的大豆抗毒素，通过抑制成骨细胞或前成骨细胞的分化，来减少骨的循环或者骨转换率(bone turnover rate),由此具有治疗或预防骨疾病的功效。并且，作为本发明的有效成分的大豆抗毒素，通过如上所述的抑制破骨细胞的分化的作用，具有治疗或预防骨疾病的功效。根据本发明的还有一个优选实例，作为利用本发明的组合物而可以治疗或者预防的骨疾病的例子，有因癌细胞的骨转移而导致的骨损伤、骨质疏松症、骨软化症、佝偻病、纤维性骨炎、骨发育不全或者代谢性骨疾病、骨溶解、白细胞减少症、骨畸形、高钙血症或者神经卡压综合症等。尤其是，本发明的组合物对骨质疏松症的预防及治疗发挥显著的功效。骨质疏松症可分为原发性(第一性)骨质疏松症和继发性(第二性)骨质疏松症。原发性骨质疏松症意味着主要发生在不适当摄取钙和维生素D，或者不进行适当的健身运动，闭经期后女性或吸烟的老年期男性身上的骨质疏松症。继发性骨质疏松症意味着因特定疾病或药物而诱发的骨质疏松症。这种情况下，年轻人身上也会诱发骨质疏松症，骨强度的减少及骨折的发生率的增加与疾病或药物的严重性与暴露在疾病或药物的期间成正比例。作为疾病，可列举甲状腺功能亢进症、甲状旁腺功能亢进症、库欣综合征(肾上腺皮质激素过度分泌疾病)、早期闭经、人工手术(卵巢切除)导致的闭经、性功能下降症、慢性肝病(肝硬化症)、类风湿性关节炎、慢性肾衰竭症及胃切除手术等，作为药物，可列举类固醇(肾上腺皮质激素)、抗惊厥剂(癫痫药)及肝素等。本发明的组合物在癌细胞或者癌组织的骨转移引起的骨疾病的预防及治疗上呈现显著效果。例如，上述癌细胞或者癌组织包含胃癌、肺癌、乳房癌、卵巢癌、肝癌、直肠癌、支气管癌、鼻咽癌、喉癌、胰脏癌、膀胱癌、结肠癌、宫颈癌、子宫内膜癌、脑癌、前列腺癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、白血病、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma)、甲状旁腺癌及尿·道癌细胞或者组织，但并不局限于此。本发明的组合物可制备为药剂学组合物。根据本发明的优选实例，本发明的组合物是一种药剂学组合物，其包含(a)大豆抗毒素的治疗学有效剂量；以及(b)药剂学上许可的载体。本说明书中的术语“治疗学有效剂量”意味着上述大豆抗毒素的用于达成骨疾病治疗或预防功效而充分的量。在本发明的组合物制备为药剂学组合物的情况下，本发明的药剂学组合物包含药剂学上许可的载体。本发明的药剂学组合物中所包含的药剂学上许可的载体为在制剂时通常利用的载体，包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿胶、磷酸钙、藻酸盐、凝胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、丙基苯甲酸甲酯、滑石、硬脂酸镁以及矿油等，但并不局限于此。本发明的药剂学组合物除了上述成分以外，还可包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂等。药剂学上许可的合适的载体及制剂详细记载于雷明登氏药学全书(Remington’sPharmaceutical Sciences, 19th ed.，1995)。本发明的药剂学组合物能够以口服或非口服方式进行投用，优选为应用口服投用方式。本发明的药剂学组合物的合适的投用量根据制剂化方式、投用方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、投用时间、投用途径、排泄速度及反应敏感性等因素，能够以多种方式进行处方。本发明的药剂学组合物的普通投用量，以成人为基准，在O. 001mg/kg-100mg/kg体重范围内。本发明的药剂学组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可容易实施的方法，并利用药剂学上许可的载体和/或赋形剂来进行制剂化，由此能够以单位容量形态制备，或者内装于多容量容器内进行制备。此时，剂型可以是油性或者水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆剂或者乳化液形态，还可以是浸膏剂、散剂、粉末剂、颗粒剂、锭剂或者胶囊剂形态，还可以包含分散剂或者稳定化剂。本发明的组合物可提供为食品组合物。根据本发明的优选实例，本发明的组合物是食品学组合物，其包含(a)大豆抗毒素的食品学有效剂量；以及(b)食品学上许可的载体。本发明的组合物制备为食品组合物的情况下，作为有效成分不仅包含大豆抗毒素，还包含制备食品时通常添加的成分，例如，包含蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养素、调味剂及香味剂。上述碳水化合物的例子，有单糖，例如葡萄糖、果糖等；二糖，例如麦芽糖、蔗糖、低聚糖等；以及多糖，例如糊精、环糊精等常规的糖以及木糖醇、山梨糖醇及赤藓糖醇等糖醇。作为香味剂可使用天然香味剂(索马甜、甜叶菊萃取物例如，莱鲍迪甙A、甘草素等)及合成香味剂(糖精、阿斯巴甜等)。例如，在本发明的食品组合物制备为保健饮料的情况下，除了本发明的大豆抗毒素以外，还可包含柠檬酸、液态果糖、食糖、葡萄糖、醋酸、苹果酸、果汁、杜仲萃取液、大枣萃取液、甘草萃取液等。有利的效果如下对本发明的特征及优点进行简略。 (i)本发明提供一种包含大豆抗毒素作为有效成分的骨疾病的治疗或预防用组合物。(ii)作为本发明的有效成分的大豆抗毒素在成骨细胞用于促进成骨细胞转录因子2蛋白质的降解，通过减少NFk B受体活化因子配体的信使核糖核酸水准来抑制成骨细胞或破骨细胞的分化，并且大大缓解因投用高容量的维生素D而被诱导骨质疏松症的动物模型的骨质疏松症状。(iii)本发明的组合物具有预防及治疗骨质疏松症等，因破骨细胞的过度增殖及活性而导致的骨疾病的功效。图Ia是在MC3T3E1细胞增殖期间，以20 μ M的浓度处理大豆抗毒素，来测定细胞的形状的结果。表示细胞的形状在经过大豆抗毒素处理的情况与未经过大豆抗毒素处理的情况类似。图Ib是在MC3T3E1细胞增殖期间，以10 μ M及20 μ M的浓度处理大豆抗毒素之后测定细胞的数量的结果。表示细胞的数量为与未经过大豆抗毒素处理的情况类似的水准。图Ic是在MC3T3E1细胞增殖期间，以10 μ M及20 μ M的浓度处理大豆抗毒素之后，经过MTT测定的结果。表示细胞的数量为与未经过大豆抗毒素处理的情况类似的水准。图Id是在诱导MC3T3E1细胞分化的同时以O μ Μ、5 μ Μ、10 μ Μ、25 μ Μ、50 μ M的浓度处理大豆抗毒素来测定成骨细胞转录因子2蛋白质的水准的结果。并表示随着大豆抗毒素的处理浓度增加，成骨细胞转录因子2蛋白质的水准减少的结果。图Ie是在诱导MC3T3细胞分化的同时以10 μ M及20 μ M的浓度处理大豆抗毒素来测定成骨细胞转录因子2的信使核糖核酸水准的结果。表示成骨细胞转录因子2的信使核糖核酸水准与大豆抗毒素的处理浓度无关地没有变化。图If是在诱导MC3T3细胞分化的同时以20 μ M的浓度处理大豆抗毒素，并比较在此处理作为蛋白酶体抑制剂的MG132的成骨细胞转录因子2蛋白质的水准与未处理作为蛋白酶体抑制剂的MG132的成骨细胞转录因子2蛋白质的水准的结果。表示处理作为蛋白酶体抑制剂的MG132的情况，针对未经过处理的情况，成骨细胞转录因子2蛋白质的水准重新恢复。
图2a是诱导从小鼠的头盖骨分离出的成骨细胞分化，并以0μΜ、10μΜ、20μΜ的浓度处理大豆抗毒素，并测定成骨细胞转录因子2蛋白质的水准的结果。并表示成骨细胞转录因子2蛋白质的水准随着大豆抗毒素的处理浓度增加而减少。D21意味着诱导成骨细胞的分化之后的第21天。图2b是在与图2a相同的条件下测定成骨细胞转录因子2的信使核糖核酸的水准的结果。表示成骨细胞转录因子2的信使核糖核酸水准与大豆抗毒素的处理浓度无关地没有变化。但是，作为成骨细胞的分化标记物的骨I丐素(Osteocalcin)的信使核糖核酸(mRNA)水准随着大豆抗毒素的处理浓度而被减少。图2c是通过实时聚合酶链式反应测定NF κ B受体活化因子配体和护骨素的信使核糖核酸水准的结果。就NF κ B受体活化因子配体而言，虽然随着大豆抗毒素的处理浓度而减少，但是，就护骨素而言，呈现出类似或者有所增加的倾向。图3a是在诱导从小鼠的头盖骨分离出的成骨细胞分化的同时，以0μΜ、10μΜ、 20 μ M的浓度处理大豆抗毒素并进行碱性磷酸酶(ALP)染色来测定的结果。通过碱性磷酸酶染色(分化后7天)的减少可确认随着大豆抗毒素的处理浓度增加而抑制成骨细胞的分化。图3b是在与图3a相同的条件下，通过茜素红(Alizarin Red)染色(分化后21天)来测定成骨细胞的分化的结果。可知，随着大豆抗毒素的处理浓度增加，成骨细胞的分化随之减少的结果。图3c是在与图3a相同的条件下，在诱导成骨细胞的分化之后第21天测定钙浓度的结果。可知，随着大豆抗毒素的处理浓度增加，钙浓度随之减少。图4&是在诱导狀胃264.7细胞分化的同时以(^] 、5 4]1、1(^]1、25 4]1的浓度处理大豆抗毒素，通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色确认分化为破骨细胞的结果。并表示随着大豆抗毒素的处理浓度增加而抑制分化为破骨细胞的结果。图5a及图5b和图6a及图6b表示利用通过高容量的维生素D投用而确立的骨质疏松症小鼠动物模型，来证明大豆抗毒素的骨保护效果的实验结果。图5a是通过微计算机断层扫描技术来分析动物模型小鼠的头盖骨的三维照片。图5b是通过微计算机断层扫描技术来分析动物模型小鼠的头盖骨之后，执行BMC分析、BMD分析及TMD分析的结果。可知，因投用高容量的维生素D而被诱导的小鼠的头盖骨的骨质疏松症状，通过投用大豆抗毒素而明确得到恢复。图6a是通过三色染色方法，在因投用高容量的维生素D而被确立的骨质疏松症动物模型中，测定因投用大豆抗毒素而致使胶原蛋白合成受到影响的结果。可知，随着大豆抗毒素的投用，胶原蛋白合成随之增加。并且，通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色测定因投用大豆抗毒素而致使破骨细胞的增殖受到影响的结果，可知，根据大豆抗毒素投用，破骨细胞的数量被减少。图6b对图6a中的测定结果进行数值化来用曲线图来表示。

理大豆抗毒素，测定成骨细胞转录因子2蛋白质的水准，其结果可知，随着经过处理的大豆抗毒素的浓度增加，成骨细胞转录因子2蛋白质的水准随之减少(参照图Id)。接着，为了确认通过大豆抗毒素处理导致成骨细胞转录因子蛋白质水准减少是否起源于成骨细胞转录因子2的信使核糖核酸水准减少，而在处理大豆抗毒素之后，勘察了成骨细胞转录因子2的信使核糖核酸水准。其结果可知，成骨细胞转录因子的信使核糖核酸量与大豆抗毒素的处理无关地没有变化(参照图le)。其次，勘察了大豆抗毒素在成骨细胞的增殖及分化过程中减少成骨细胞转录因子2蛋白质的量的效果是否通过促进泛素结合的成骨细胞转录因子2蛋白质的降解来降低成骨细胞转录因子2蛋白质的稳定性的机制来实现。通过利用作为蛋白酶体抑制剂(proteasomeinhibitor)的MG132处理成骨细胞,来确认Runx2蛋白质的水准,其结果已确认，因大豆抗毒素而被减少的成骨细胞转录因子2蛋白质的量借助MG132的处理而得到恢复(参照图If)。这些结果证实了大豆抗毒素促进在成骨细胞中与泛素结合的成骨细胞转录因子2的降解，由此具有抑制成骨细胞的分化的效果。就大豆抗毒素的功能而言，对从小鼠的头盖骨分离出的成骨细胞进行分化(诱导分化后，经21天)，以O μ Μ、10 μ Μ、20 μ M的浓度处理大豆抗毒素之后，分离与成骨细胞的分化相关的蛋白质和信使核糖核酸，来勘察这些的水准。如同上述，在MC3T3细胞中再次证明了，随着大豆抗毒素的处理浓度增加，成骨细胞转录因子2蛋白质水准随之减少(参照图 2a)，然而信使核糖核酸水准无任何变化(参照图2b )。可见，鉴于随着大豆抗毒素的处理浓度增加，作为成骨细胞分化标记物的骨钙素的信使核糖核酸水准随之减少，可知分化为成骨细胞的过程将被大豆抗毒素抑制(参照图2b)。并且，通过实时聚合酶链式反应(Real-time PCR)勘察到，在成骨细胞分化过程中分泌而促进破骨细胞的分化的NF κ B受体活化因子配体及作为NF κ B受体活化因子配体的受体的护骨素的信使核糖核酸表达水准。其结果，已确认到NF κ B受体活化因子配体的信使核糖核酸水准随着大豆抗毒素的浓度增加而被减少，但是存在护骨素的信使核糖核酸水准没有变化或者有所增加的倾向(参照图2c)。结果已确认，大豆抗毒素在成骨细胞的分化过程中减少NF κ B受体活化因子配体/护骨素比(参照图2c)。其结果，推定为，虽然大豆抗毒素在成骨细胞的增殖过程中没有太大影响，但在分化过程中通过促进成骨细胞转录因子2的蛋白质降解来抑制分化，由此减少NFk B受体活化因子配体/护骨素比，从而抑制破骨细胞的分化。实验例2:大豆抗毒素的成骨细胞分化抑制效果在诱导从小鼠头盖骨分离出的成骨细胞分化的过程中，以0μΜ、10μΜ、20μΜ的不同浓度处理大豆抗毒素，通过ALP染色(诱导分化后7天)和茜素红染色(诱导分化之后21天)来测定分化程度，其结果已确认，随着大豆抗毒素的浓度增加，成骨细胞的分化随之抑制(参照图3a、图3b)。并且，测定钙浓度(诱导分化之后21天)，其结果已确认，随着大豆抗毒素的浓度增加，钙浓度随之减少(参照图3c)。这些结果与实验例I所示的在成骨细胞的分化过程中勘察功能基因的结果一致。实验例3:大豆抗毒素的破骨细胞分化抑制效果在诱导将狀1264.7细胞分化为破骨细胞的过程中，以0“] 、54]1、1(^]1、254]1的不同浓度处理大豆抗毒素，经过4天之后，通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色法观察了破骨细胞。其结果已确认，随着大豆抗毒素的浓度增加，经过抗酒石酸酸性磷酸酶染色的破骨细胞随之减少(参照图4a)。这些结果与实验例I所示的在成骨细胞分化过程中勘察功能基因的
结果一致。
实验例4:大豆抗毒素在骨质疏松症诱导小鼠模型中起到的保护骨效果为了通过体内(in vivo)实验验证在体外(in vitro)所验证的大豆抗毒素的破骨细胞分化抑制效果，给小鼠一天注射一次高容量的维生素D，如此共注射3天，来诱导骨质疏松症。从首次注射维生素D的当天开始，将大豆抗毒素按一天一次以不同浓度注射9天之后，第10天致死小鼠，通过微计算机断层扫描技术分析、三色(TrichiOme)染色及抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察了头盖骨。其结果已确认，骨矿含量(bone mineral contents, BMC)、骨矿密度(bone mineral density, BMD)、组织矿物含量(tissue mineral contents, TMC)随着大豆抗毒素的浓度增加而增加(参照图5a及图5b)。通过三色染色已确认，作为骨的细胞外基质的胶原蛋白随着投用大豆抗毒素而增加，通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞的结果，已确认根据大豆抗毒素，破骨细胞的数量会减少(参照图6a及图6b)。以上，详细说明了本发明的特定部分，对于本发明所属技术领域的普通技术人员而言，这些具体的说明仅作为优选实例，本发明的范围并不局限于此是显而易见的。因此，应视为本发明的实质性范围根据所附的权利要求书及其等价物来定义。·


本发明涉及一种包含大豆抗毒素作为有效成分的骨疾病的治疗或预防用组合物。作为本发明的有效成分的大豆抗毒素在成骨细胞中促进成骨细胞转录因子2蛋白质的降解，并减少核因子κB受体活化因子配体的信使核糖核酸水准，来抑制破骨细胞的分化，并且，大大缓解因投用高容量的维生素D而患有骨质疏松症的动物模型的骨质疏松症状。本发明的组合物开发为因骨质疏松症及癌细胞的骨转移而产生骨疾病等的预防及治疗用食品的可能性巨高。