专利名称：利用球形微载体生物反应器培养细胞生产禽流感疫苗的方法过去我国一直通过鸡胚培养生产流感疫苗。由于鸡胚生产流感疫苗需要消耗大量鸡胚，生产周期长，易污染，不易于控制，而且每只受精鸡蛋一次只能注射一个病毒菌株，因此这种生产方法效率很低，不利于应对大规模的流感爆发。以哺乳动物细胞为基质制备疫苗具有无外源因子污染、易于规模化生产、能较好的维持病毒抗原稳定等优点。但是，仅仅依靠动物细胞培养生产病毒的量有限，因此将载体培养技术应用于禽流感疫苗的生产，无疑将既保持细胞培养的优势又克服了其生产产量有限的缺点。球形微载体在生物制药行业广泛使用。使用球形微载体培养细胞繁殖禽流感病毒生产疫苗具有以下优点1)产品批间差异小；2)无细菌污染，产品内毒素含量低；3)产品灭活时，甲醛使用量低，因此产品甲醛含量也低；4)产品质量稳定，鸡免疫疫苗后应激小；5)生产周期短；6)易于放大；7)不受胚蛋供应的影响。
为此，本发明提供了一种利用球形微载体生物反应器培养细胞生产禽流感疫苗的方法。该方法克服传统工艺生产禽流感疫苗，生产周期长、批间差异大、内毒素含量高、受胚蛋供应的影响，也克服片状载体难于放大的影响。制备的禽流感病毒疫苗产品批间差异小，无细菌污染，产品内毒素含量低，产品甲醛含量也低，质量稳定，生产周期短，易于放大。本发明的技术方案如下利用球形微载体生物反应器培养细胞生产禽流感疫苗的方法，包括如下具体步骤I :选择导入载体所需要的种细胞MDCK或者Vero ；2 :转瓶繁殖细胞传代的方法首先复苏步骤I所选择的种细胞到T225的细胞瓶中，生长48h左右，按照I :4的比例进行传代；然后把4个长满细胞的T225细胞瓶中的细胞传到I个15L转瓶进行培养；48小时左右按照I :4或I :3的比例进行细胞传代培养；3 :收获转瓶中的细胞将步骤2所得细胞用PBS洗涤2-3次，然后加入胰酶-EDTA溶液消化；15L转瓶加入100-150ml胰酶-EDTA溶液，其它类型的转瓶按照类似比例添加胰酶-EDTA溶液消化，然后收集细胞；4 :收获的细胞计数后，按照每个微载体添加5-20个细胞的比例进行细胞接种；每升培养基中加入2-10克微载体；5 :生物反应器培养接种细胞生物反应器培养细胞的培养基为MEM (Hyclone);血清使用浓度为7_10% ；C02通气量为5-10% ;溶氧量为40-60%的溶液饱和溶氧量；温度为37°C ;搅拌速度为30-55转/分，pH为6. 8-7. 4 ；90-95%以上的微载体在细胞接种后48_72h期间能够达到接种禽流感病毒的要求；6 :步骤5培养的细胞达到接种禽流感病毒的要求后，接种禽流感病毒，方法如下6.1)清洗微载体先沉淀长满细胞的微载体，然后用PBS清洗清洗微载体；6. 2)病毒接种然后加入禽流感病毒-MEM溶液进行病毒接种，病毒接种过程中培养基的体积为生物反应器工作的体积1/4-1，病毒接种剂量为O. 00001-1. 0ΜΙ0，接种过程中不加血清；6. 3)孵育禽流感病毒与细胞禽流感病毒接种后，向生物反应器中补足生物反应器正常工作所需要的培养基，在禽流感病毒与细胞孵育的过程中，轻轻搅拌微载体使细胞与禽流感病毒充分接触，搅拌速度为30-45转/分，禽流感病毒与细胞孵育时间为O. 5-10小时；7 :禽流感病毒繁殖病毒繁殖培养基为MEM (Hyclone) ；C02通气量为5_10% ;溶氧量为40-60%的溶液饱和溶氧量；温度为37°C;搅拌速度为30-45转/分，pH为6. 5-7. 2 ;病毒繁殖的时间为24-72h ；8 :离心收集步骤7所得禽流感病毒液，离心速度为3000-4500转/分，离心时间为20-30分钟；9:灭活步骤8所得禽流感病毒液中的禽流感病毒使用甲醛灭活禽流感病毒，加入的甲醛终浓度为O. 01%-0. 2%,灭活的时间为24小时，灭活的温度为15-37°C ;在灭活的过程中进行搅拌使甲醛与病毒混匀；10 :然后按照常规方法制备禽流感细胞苗，即按照油相水相为2 1的体积比例制备疫苗，先把油相进行灭菌处理，然后把步骤9所得完全灭活的禽流感病毒液慢慢倒入搅 拌中的油相，乳化制得疫苗；11 :禽流感细胞苗免疫21日龄的SPF鸡，免疫剂量为O. 3ml，免疫后14天、21天分别采血进行测定血清中抗禽流感特异性抗体的滴度(HI)。较佳地，步骤6. 3中，禽流感病毒与细胞孵育时间不低于I个小时；较佳地，步骤7中，病毒繁殖过程中，当病毒繁殖培养基pH低于6. 5或者禽流感病毒HA价高于9. O,就更换部分溶液。所述微载体为Cytodex I 或 hyclone。本发明的有益效果为本发明所述利用球形微载体生物反应器培养细胞生产禽流感疫苗的方法，禽流感病毒滴度(HA)不低于9. 0，比传统细胞繁殖禽流感病毒的方法，禽流感病毒滴度(HA)提高了不低于2倍；与传统鸡胚生产禽流感疫苗相比，生产周期缩短一半以上，是一个值得推广应用的方法。 鸡的种类数量免疫剂量抗体水平(H1)14 天 21 天 28 天SPF 鸡10 0.3ml5.5 7 ^ 8.0
本发明提供了一种利用球形微载体生物反应器培养细胞生产禽流感疫苗的方法,包括如下具体步骤:选择种细胞；转瓶繁殖细胞传代；收获转瓶中的细胞；细胞接种；生物反应器培养接种细胞；接种禽流感病毒;禽流感病毒繁殖;收集禽流感病毒液；对禽流感病毒细胞液进行灭活;制备禽流感细胞苗；禽流感细胞苗免疫。该方法克服传统工艺生产禽流感疫苗，生产周期长、批间差异大、内毒素含量高、受胚蛋供应的影响，也克服片状载体难于放大的影响。制备的禽流感病毒疫苗产品批间差异小，无细菌污染，产品内毒素含量低，产品甲醛含量也低，质量稳定，生产周期短，易于放大。