建立食蟹猴实验性自身免疫脑脊髓膜炎模型的方法及应用的制作方法[0002]实验性自身免疫脑脊髓炎(experimentalautoimmune encephalomyelitis, EAE)是由同种型、同种异型、异种异型致脑炎抗原诱导的、实验敏感动物产生的、由细胞免疫反应介导的、以中枢神经系统(central nervous system, CNS)白质脱髓鞘为特征的迟发型变态反应性自身免疫疾病，其免疫发病机制和病损与人类多发性硬化(multiplesclerosis, MS)极为相似，被公认为是研究多发性硬化疾病的理想模型。[0003]目前实验性自身免疫脑脊 髓炎(EAE)模型通常是建立在啮齿类动物上的。由于啮齿类在进化关系上与人类相距甚远，实践表明，啮齿类动物实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)模型产生的实验结果在临床实验中很难得到验证；以此模型进行药物开发的成功率较低；以其为研究对象所获得的实验数据对现实指导意义不大。非人灵长类的解剖特点、免疫等各系统生理功能、及对疾病和治疗药物的反应性等与人类极为相近，是进行免疫学相关疾病研究和治疗、以及进行药物临床前有效性和安全性评价的敏感动物。[0004]随着新药研发技术的发展，尤其是大分子药物(如抗体，核酸，蛋白类药物)技术的成熟，药物特异性作用靶点以及与试验模型交叉反应性是药物研发成功的重要影响因素。非人灵长类动物和人体的亲缘相近，靶点的结构和生物系统相似，有很好的交叉反应性。因此建立非人灵长类实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)模型将满足多发性硬化治疗药物临床前评价的迫切需要，模型数据对多发性硬化的研究以及对治疗方案等临床应用具有重要的指导意义。[0005]MOG是一种表达在中枢少突胶质细胞和髓鞘莫表面的跨膜糖蛋白，在体内含量很少却具有很高的免疫原性。研究表明，MOG是唯一能引起脱髓鞘抗体反应，又能引起T细胞反应的中枢神经系统髓鞘蛋白成分。因此，用MOG作为免疫原来诱导产生实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)能更好的帮助阐明多发性硬化(MS)的发病机制。[0006]Herbert P.Μ.Brok 等曾报道了使用 MOG 诱导恒河猴(Macaca mulatta)的 EAE 模型，其方法为:用恒河猴作为实验动物，将Iml浓度为100μ g/ml的MOG乳剂(PBS:CFA =1:1)分10个点注射于皮内；4周后再次皮内注射Iml浓度为100 μ g/ml的乳剂(NS.:1FA=1:1)，结果实验猴都出现了 EAE的症状。但该方法的缺点是:1.诱导周期太长；2.采用较为主观的疾病症状评分标准；3.恒河猴个体较大。这些缺点阻碍了该模型在科研、药物研发、以及产业化实践中的应用。[0007]本发明结合中国食蟹猴(Macaca fascicularis)实验动物大量存栏的现状,在反复研究经验的基础上，创新使用M0G(M0G34-56的肽段)二次免疫方法，在食蟹猴实验动物上诱导产生非人灵长类EAE模型。二次注射M0G34-56免疫诱导后，动物表现为起病急以及缓解-复发的发病特点。同时，引入临床磁共振(MRI)影像学结合临床观察评分的方法，最大程度减少了疾病临床评价的人为因素。本发明建立的模型具有发病特点和病理学表现与人类多发性硬化有高度的相似性、MRI影像学方法准确评估发病部位及发病程度等特点。

[0008]本发明建立了一种食蟹猴实验性自身免疫脑脊髓膜炎模型的方法。
[0009]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0010]a、乳剂配制:将 M0G34-56 (100 μ g/ml)配制成乳剂(M0G 溶液:CFA = 1:1)；
[0011]b、将实验猴麻醉后，分10个注射点，皮内注射Iml配制的乳剂；
[0012]C、第一次免疫注射后的第7天，按同样的方法和剂量再免疫注射一次乳剂；
[0013]d、自第一次免疫后I天进行临床观察，并记录临床评分；
[0014]e、在发病的各时间节点，用MRI影像学方法确定发病部位及发病程度等。
[0015]本发明所提供的一种食蟹猴实验性自身免疫脑脊髓膜炎模型的建立方法，优选的是:创新的使用M0G34-56肽段进行两次免疫。
[0016]本发明所提供的一种食蟹猴实验性自身免疫脑脊髓膜炎模型的建立方法，优选的是:创新使用食蟹猴(Macaca fascicularis)作为实验动物。
[0017]本发明所提供的一种食蟹猴实验性自身免疫脑脊髓膜炎模型的建立方法，优选的是:MRI影像学结合临床观察评分的方法。
[0018]本发明的优点是:
[0019]本发明动物模型具有啮齿类动物模型无法实现的应用价值:
[0020]a、解剖特点、免疫等各系统生理功能、及对疾病和治疗药物的反应性与人类极为相近；
[0021]b、和人亲缘相近，靶点的结构和生物系统相似，为药物特异性(如抗体，核酸，蛋白类药物等)作用靶点提供很好的交叉反应性。
[0022]本发明动物模型与恒河猴模型相比更具有实际应用价值:
[0023]a、发病特点与人类多发性硬化有高度的相似性；尤其是具备了复发缓解型的发病特征；
[0024]b、与恒河猴相比动物个体小，使用较少受试药物，降低成本；
[0025]C、采用猴场大量繁育的食蟹猴，遗传背景清楚，质量控制严格，实验猴资源丰富。
[0026]本发明动物模型采用M0G34-56肽段间隔7天两次免疫的方法，缩短了模型的诱导期。
[0027]本发明动物模型使用MRI影像学结合临床观察评分的方法，最大程度减少了疾病临床评价的人为因素。
[0028]本发明动物模型在多发性硬化疾病的相关领域有广泛的用途，例如:
[0029]a、利用模型进行多发性硬化疾病的发生、发病机制、诊断、生物识别、和转化医学研究；
[0030]b、利用模型的发病率、发病程度、和发病特征，进行多发性硬化疾病的预防、治疗、护理、以及对各类治疗技术和新药进行评价和药效研究等；
[0031]C、利用模型的试验建立新的多发性硬化疾病的指标、评分标准等；
[0032]d、利用模型的动物材料建立多发性硬化疾病研究相关的数据库、基因库、材料库坐寸O



[0033]图1是M0G34-56诱导食蟹猴EAE不同时间的临床评分图，显示发病-恢复-复发的病程特征
[0034]以下通过
【具体实施方式】
[0035]为了可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，下面结合实施例进一步阐述本发明，但不以任何方式限制本发明。[0036]实验动物:4只食蟹猴(Macaca fascicularis,雄性,4岁，体重3_5千克)，购自海南金港实验动物科技有限公司。
[0037]主要试剂:完全弗氏佐剂(Complete Freund adjuvant, CFA),购自Sigma公司；M0G34-56购自吉尔生化(上海)有限公司。
[0038]主要溶液的配制:将M0G34-56溶解于生理盐水中，在4°C条件下用等体积CFA乳化5分钟。
[0039]主要仪器:磁共振仪(GE)，1.5T。
[0040]实验方法:
[0041]将配制好的MOG-CFA乳剂，分十点注射于皮内，每猴1ml。
[0042]自注射(免疫)后I天起，进行临床观察，并进行症状临床评分。
[0043]并于首次注射(免疫)后的第7天按相同剂量和方法进行第二次免疫注射。
[0044]根据发病后临床评分需要时，进行MRI扫描。
[0045]MRI扫描步骤:
[0046]用盐酸氯胺酮麻醉实验猴，并以戊巴比妥钠深度麻醉后，实验猴于MRI机上固定体位,设定特定部位和坐标进行MRI扫描。
[0047]实验结果:
[0048]3只食蟹猴在首次免免疫注射后4周内均出现明显MS临床症状，I只食蟹猴于第8周出现明显MS临床症状。
[0049]模型成功率:
[0050]本模型的成功率为100%。
[0051]注意事项:
[0052]在本模型的整个操作过程中时刻注意人和实验动物的安全。
[0053]

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[0054]图2是皮内注射M0G34-56乳剂的注射部位及免疫效果图
[0055]图3是多发性硬化(MS)病人(左图)和M0G34-56诱导的食蟹猴EAE(右图)脑部磁共振(MRI)成像对比图，显示食蟹猴与人具有相似的脑部构造，显示M0G34-56诱导的食蟹猴EAE和MS病人具有相似的脑内多发病变灶。[0056]图4是磁共振(MRI)不同轴向扫描显示M0G34-56诱导EAE的食蟹猴脑病变灶图，其与临床评分的对比，显示病变程度与评分高低的关系。
[0057] 图5是M0G34-56诱导EAE食蟹猴的脑部MRI显示病灶与脑组织切片对比图，显示在MRI病灶区域同一位置的脑组织病理切片有清晰可见出血性损伤。
[0058]图6是M0G34-56诱导EAE食蟹猴的脑组织病理切片(H&E染色)图，显示病灶内的出血点(左上角)和炎性细胞浸润(右下角)。