专利名称：食蟹猴抗利尿激素受体v1a拮抗剂筛选平台的建立的制作方法最近一段时间，抗利尿激素受体选择性拮抗剂的研发成为热点，已经证明有着广阔的临床应用前景。抗利尿激素是由下丘脑的视上核和室旁核的神经细胞分泌的9肽激素，经下丘脑-垂体束到达神经垂体后释放出来。其主要作用是提高远曲小管和集合管对水的通透性，促进水的吸收，是尿液浓缩和稀释的关键性调节激素。当给药剂量远远大于其发挥抗利尿激素效应时，它将作为ー种非肾上腺素能样的周围血管收缩药发挥作用。此外，该激素还能增强内髓部集合管对尿素的通透性。血管加压素AVP受体是G蛋白偶联受体，包括血管紧张性受体(Via)、血小板聚集性受体(Vlb)、刺激同性离子和心肌蛋白合成受体(Vla)和下丘脑ACTH分泌受体(Vlb)。在最近的临床研究中，Vla受体的拮抗剂最近发现可以有效地抑制攻击性行为，这些结果意味着这些拮抗剂可以应用在针对自闭症，双重人格以及吸毒者的暴力行为的控制上。作为ー种重要的实验动物，食蟹猴Vla受体细胞系的建立能够对Vla受体拮抗剂的研发提供有效的筛选平台。
本发明的目的，就是为了解决上述问题，提供ー种食蟹猴抗利尿激素受体VlA拮抗剂筛选平台的建立。为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案ー种食蟹猴抗利尿激素受体VlA拮抗剂筛选平台的建立，其特征在于，包括以下步骤A、在384孔板里每孔植入I. 5万个中国仓鼠卵巢细胞的阳性克隆细胞，在37°C、5%ニ氧化碳氛围的培养箱里培养16-24小时；B、弃去培养基，200转/分离心10秒去除残留培养基，每孔加入30微升钙离子检测染料，在37°C、5%ニ氧化碳氛围的培养箱里培养90分钟；C、用钙离子检测缓冲液配制4X的激动剂d [Cha4] -AVP和IX的待测药物；D、细胞孵育90分钟后，弃去钙离子检测染料，200转/分离心10秒去除残留染料；E、每孔加入30微升IX的待测药物，25°C孵育15分钟，然后每孔再加入10微升4X的激动剂d[Cha4]-AVP ；F、在室温下用酶标仪检测，能够抑制激动剂引起的钙离子释放的药物为食蟹猴抗利尿激素受体VlA拮抗剂。2、根据权利要求书I所述的食蟹猴抗利尿激素受体VlA拮抗剂筛选平台的建立，其特征在于所述的中国仓鼠卵巢细胞的阳性克隆细胞按以下步骤制备一、质粒转染A、在6孔板里，每孔植入两百万个中国仓鼠卵巢细胞，用F12/10%胎牛血清的培养基培养16-24小时；B、稀释5微升脂质体到125微升OptiMEM I低血清培养基，温和混匀，室温放置5分钟；稀释2微克食蟹猴抗利尿激素受体克隆质粒到125微升OptiMEM I低血清培养基中，温和混匀，室温放置5分钟；将上述两者温和混匀，室温放置30分钟后，加入6孔板中，轻轻混匀；C、在37で、5%ニ氧化碳氛围的培养箱里培养24小时后，形成转染体以备筛选；ニ、克隆筛选D、将F12/10%胎牛血清的培养基培养过夜，将转染体分别稀释成I : 20、1 40和I : 80浓度，分别加入含有潮霉素400微克/毫升的上述培养过夜的培养基培养；E、接下来2周内每天更换培养基，直到没有转染质粒的细胞全部死亡后，进行克 隆挑选，挑选出克隆的稳定表达食蟹猴抗利尿激素受体细胞进行下ー步骤；三、用酶标仪筛选阳性克隆细胞F、将挑选出的克隆细胞以5万个细胞/孔的浓度植入96孔板中，在37°C、5%ニ氧化碳氛围的培养箱里培养过夜，然后弃去培养基，每孔加入100微升钙离子检测染料，在37で、5%ニ氧化碳氛围的培养箱里培养90分钟；G、准备浓度为I. 5微摩的激动剂d[Cha4]_AVP，每孔加入25微升激动剂；H、用酶标仪检测克隆细胞的钙离子水平，激动剂能够有效刺激钙离子水平提高的克隆细胞为阳性克隆细胞。本发明食蟹猴抗利尿激素受体VlA拮抗剂筛选平台的建立，以细胞水平的钙流水平为主要检测方法，建立了ー套对筛选食蟹猴抗利尿激素受体VlA拮抗剂药物的方法。首次实现了在中国仓鼠卵巢细胞中稳定表达食蟹猴抗利尿激素受体，首次建立并优化了对食蟹猴抗利尿激素受体药物高通量筛选的平台。F、将挑选出的克隆细胞以5万个细胞/孔的浓度植入96孔板中，在37°C、5%ニ氧化碳氛围的培养箱里培养过夜，然后弃去培养基，每孔加入100微升钙离子检测染料，在37で、5%ニ氧化碳氛围的培养箱里培养90分钟；G、准备浓度为I. 5微摩的激动剂d[Cha4]_AVP，每孔加入25微升激动剂；H、用酶标仪检测克隆细胞的钙离子水平，激动剂能够有效刺激钙离子水平提高的克隆细胞为阳性克隆细胞。用酶标仪检测时,各项參数设置如表I所示表I一种食蟹猴抗利尿激素受体V1A拮抗剂筛选平台的建立，方法是，首先培养中国仓鼠卵巢细胞的阳性克隆细胞，弃去培养基后加入钙离子检测染料继续培养，弃去钙离子检测染料后加入待测药物孵育，然后再加入激动剂d[Cha4]-AVP，用酶标仪检测，能够抑制激动剂引起的钙离子释放的药物为食蟹猴抗利尿激素受体V1A拮抗剂。本发明以细胞水平的钙流水平为主要检测方法，建立了一套对筛选食蟹猴抗利尿激素受体V1A拮抗剂药物的方法。首次实现了在中国仓鼠卵巢细胞中稳定表达食蟹猴抗利尿激素受体，首次建立并优化了对食蟹猴抗利尿激素受体药物高通量筛选的平台。