专利名称：含eb病毒潜伏膜蛋白2基因的重组腺病毒疫苗的制作方法发明所属领域本发明涉及含EB病毒潜伏膜蛋白2基因的复制缺陷型重组腺病毒制备方法。本发明进一步涉及所说的复制缺陷型重组腺病毒在预防和治疗EB病毒相关肿瘤的疫苗中的应用。发明的背景在恶性肿瘤中，病毒性抗原是最具免疫原性的分子，并且是一种最有意义的肿瘤抗原。作为疱疹病毒科的成员，Epstein-Barr病毒(以下简称EB病毒或EBV)是第一个被发现的人类肿瘤相关病毒。现已明确，EB病毒是导致人鼻咽癌(NPC)、Burkitt淋巴瘤(BL)及免疫抑制后淋巴瘤的主要病因之一。而且也已表明，EB病毒与何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤，以及外周血T细胞淋巴瘤的发生有关。此外，还发现一些其他肿瘤如胃癌、肺癌和胸腺癌等肿瘤组织中存在有EB病毒DNA。EB病毒潜伏膜蛋白2(LMP2)是一种在鼻咽癌等EB病毒相关肿瘤组织中持续表达并且存在于肿瘤细胞的表面的病毒蛋白质。LMP2基因并不能导致B淋巴细胞的转化并且没有致癌性。在EB病毒诱导产生特异性细胞毒性淋巴细胞(CTL)表位的体外实验中发现，LMP2含有多种受人类白细胞抗原(HLA)限制的CTL表位，而且其序列具有较高的保守性。因此，LMP2很有可能作为体内诱导EB病毒特异性CTL并用于预防和治疗相关肿瘤的良好靶抗原。在本发明之前，临床上曾有人使用LMP2特异性CTL治疗EB病毒相关的淋巴细胞增生症，并取得了良好的治疗效果。由于腺病毒具有宿主范围广泛、可感染分裂期细胞和静止或终末分化细胞、可诱发较强的细胞免疫反应、可高效感染树突状细胞(DC)以及使用方便等优点，所以腺病毒载体目前已被广泛用于基因治疗和制备疫苗的外源基因载体(Kai，MA.，D.Liu，and P.Hoogerbrugge..Proc.Natl.Acad.Sci.USA1997，9412774-12776.)。例如，已有人将携带黑素瘤相关抗原(MART1)或多瘤病毒T抗原基因的重组腺病毒用于人的体外或小鼠的体内治疗(分别参见Souberbielle，BE. & Russell，WC.，Journal of Infectious Diseases，172，1421-1422，1995；Flomenberg，P.，et al.，Journal of Infectious Diseases，171，1090-1096，1995)。甚至也有人成功地借助典型腺病毒载体表达LMP2蛋白并用所得表达产物免疫小鼠。然而，迄今尚未见使用腺病毒作载体，成功地制备以EB病毒的潜伏膜蛋白2为靶抗原的EB病毒相关肿瘤治疗性疫苗的报道。发明的目的本发明的一个目的是提供一种复制缺陷型重组腺病毒，特征在于所说的病毒携带有编码EB病毒潜伏膜蛋白2的DNA序列。根据本发明重组腺病毒的一个优选实施方案，其中所说的复制缺陷型重组腺病毒的病毒滴度不小于109pfu/ml。根据本发明重组腺病毒的一个优选实施方案，其中所说的复制缺陷型重组腺病毒可在体内诱导EB病毒特异性细胞毒性淋巴细胞反应。本发明的另一个目的是提供生产如上限定的复制缺陷型重组腺病毒的方法，该方法包括(1)将编码LMP2蛋白质的DNA序列克隆到适当的腺病毒穿梭质粒中，得到携带LMP2之DNA编码序列的重组腺病毒穿梭质粒；(2)用步骤1的重组穿梭质粒和腺病毒骨架质粒共转化适当的宿主细胞；(3)在适当条件下使步骤2的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒进行同源重组的，得到携带LMP2之DNA编码序列的重组腺病毒载体；(4)将步骤3的重组腺病毒载体导入适当的腺病毒包装细胞，得到所需的复制缺陷型重组腺病毒。根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的腺病毒穿梭质粒是质粒pShuttle-CMV。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的腺病毒骨架质粒是质粒pAdEasy-1。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的宿主细胞是大肠杆菌BJ5183。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的腺病毒包装细胞是293细胞。
本发明的再一个目的是提供如上限定的复制缺陷型重组腺病毒作为EB病毒相关肿瘤治疗性疫苗的应用。
根据本发明应用的一个优选实施方案，其中所说的疫苗的靶抗原是EB病毒的潜伏膜蛋白2。
根据本发明应用的一个优选实施方案，其中所说的其中所说的复制缺陷型重组腺病毒的病毒滴度不小于109pfu/ml。
根据本发明应用的一个优选实施方案，其中所说的复制缺陷型重组腺病毒可在体内诱导抗EB病毒LMP2蛋白特异性抗体反应和EB病毒特异性细胞毒性淋巴细胞反应。
根据本发明应用的一个优选实施方案，其中所说的疫苗是经胃肠道外途径投用的。
附图简要描述

图1A和B是腺病毒穿梭质粒(A)和腺病毒骨架质粒(B)的结构示意图(引自He TC，1998)。
图2显示充足腺病毒包装(构建)流程图(引自He TC，1998)。
图3显示以RT-PCR方法检测的本发明重组腺病毒(rAd-LMP2)感染的293细胞中LMP2的DNA编码序列的转录。其中泳道1是分子量(2000道尔顿)标记；泳道2是感染本发明重组腺病毒(rAd-LMP2)的293细胞总RNA的RT-PCR产物；泳道3是感染本发明重组腺病毒(rAd-GFP-LMP2)的293细胞总RNA的RT-PCR产物；泳道4是感染野生腺病(Ad5)的293细胞总RNA的RT-PCR产物。
图4显示以免疫印迹法检测rAd-LMP2感染的293细胞内LMP2的表达。其中泳道1是B95-8细胞；泳道2是Ad5感染的293细胞；泳道3是rAd-LMP2感染的293细胞；泳道1是rAd-GFP-LMP2感染的293细胞。
图5显示通过不同途径接种本发明的重组腺病毒后，被免疫动物的CTL水平的比较。
发明的详细描述本发明涉及携带EB病毒潜伏膜蛋白2之DNA编码序列的复制缺陷型重组腺病毒及其制备方法。本发明进一步涉及所说的复制缺陷型重组腺病毒作为治疗性疫苗在预防和治疗EB病毒相关肿瘤中的应用。
鼻咽癌是一种常见的恶性肿瘤，在中国南方一些省区具有较高的发病率。目前常用的治疗方法主要是放射治疗。由于鼻咽癌特别是中晚期鼻咽癌治疗后的复发和转移率很高，所以往往导致治疗失败。近几十年来，随着分子生物学和肿瘤免疫学的研究进展，使用分子生物学手段预防鼻咽癌复发和转移并作为传统治疗方法的补充，已受到人们越来越多的重视。
已有充分证据表明，EB病毒与鼻咽癌(NPC)密切相关(Liu ZS，etal.，J.Cancer Res.Clin.Oncol.，1243541-548，1998)，而且是导致鼻咽癌及其他一些淋巴瘤的主要病原因子。随着对EB病毒特异性基因片段和病毒抗原决定基研究的不断深入，人们已发现包括鼻咽癌在内的一些EB病毒II型潜伏感染相关肿瘤的瘤细胞均有EBNA1-6、LMP1和LMP2的表达。LMP2是第8个被确定的EB病毒潜伏蛋白，特别是LMP2A分子中至少有9种HLA限制的LMP2表位。进一步的研究表明，LMP2可能具有维持病毒在细胞内的潜伏感染状态的功能(Speck p et al.，J，Gen.Virol.，802193-2203，1999)。
Rooney等人利用反转录病毒和单纯疱疹病毒作载体，将LMP2导入树突状细胞(DC)并表达之，借以刺激并激发何杰金氏病病人体内的特异性细胞毒性淋巴细胞(CLT)反应，获得有益的经验(Rooney CM，Ann.Oncol.，9(Suppl.5)s129-s132.1997)。
林毓纯等人的早期研究发现，NPC病人的T淋巴细胞对自身肿瘤细胞具有特异性杀伤作用，而且这种作用与人白细胞抗原有关(林毓纯，赵文革，曾毅等，中华肿瘤学杂志，4(4)254-256，1982)。
上述这些和其他相关研究成果为利用LMP2特异性CTL治疗未分化和低分化鼻咽癌提供了科学依据。本发明人试图在建立一个适当的LMP2表达系统的基础上，使LMP2蛋白在细胞内以内源蛋白质的形式表达，然后与组织相容性复合体(MHC)分子结合并一同呈递到细胞表面，进而通过激活记忆性T细胞达到增强NPC病人的抗肿瘤免疫反应的目的。
为了引发针对LMP2的特异性CTL反应，必须首先须选择一个适于治疗应用的LMP2表达系统。鉴于腺病毒具有宿主范围广泛、能够感染分裂期细胞和静止或终末分化细胞并诱发较强的细胞免疫反应、可高效感染树突状细胞(DC)以及使用方便等优点，特别是复制缺陷型重组腺病毒更具有安全性好的优点，所以我们确定以腺病毒作为LMP2的病毒载体。
因此，本发明的一个目的是提供一种复制缺陷型重组腺病毒，特征在于所说的病毒携带有编码EB病毒潜伏膜蛋白2的DNA序列。
根据本发明重组腺病毒的一个优选实施方案，其中所说的复制缺陷型重组腺病毒的病毒滴度不小于109pfu/ml，并可在体内诱导EB病毒特异性细胞毒性淋巴细胞反应。
为了得到本发明的携带EB病毒潜伏膜蛋白2(LMP2)的DNA编码序列的复制缺陷型重组腺病毒，我们首先由携带LMP2的DNA编码序列的已知质粒(例如Psg5-LMP2)中得到LMP2的全长度cDNA序列，并将其定向克隆到腺病毒穿梭质粒中。然后使用所得到的重组腺病毒穿梭质粒与已知的腺病毒骨架质粒一起共转染大肠杆菌宿主细胞，并借助宿主细胞的重组酶使两质粒间发生同源重组。然后基于质粒同源重组后获得的抗生素抗性(例如卡那霉素抗性)筛选阳性菌株，并由之得到所需的重组腺病毒质粒。最后，再借助质脂体将重组腺病毒质粒转染已知的腺病毒包装细胞中，并在由所说的包装细胞提供的E1蛋白的反向作用下包装病毒(参见图1和2)。
因此，本发明的另一个目的是提供生产如上限定的复制缺陷型重组腺病毒的方法，该方法包括(1)将编码LMP2蛋白质的DNA序列克隆到适当的腺病毒穿梭质粒中，得到携带LMP2之DNA编码序列的重组腺病毒穿梭质粒；(2)用步骤1的重组穿梭质粒和腺病毒骨架质粒共转化适当的宿主细胞；(3)在适当条件下使步骤2的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒进行同源重组的，得到携带LMP2之DNA编码序列的重组腺病毒质粒；(4)将步骤3的重组腺病毒质粒导入适当的腺病毒包装细胞，得到所需的复制缺陷型重组腺病毒。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的腺病毒穿梭质粒是质粒pShuttle-CMV。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的腺病毒骨架质粒是质粒pAdEasy-1。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的宿主细胞是大肠杆菌BJ5183。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的腺病毒包装细胞是293细胞。
本发明方法中所使用的腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV、腺病毒骨架质粒pAdEasy-1、大肠杆菌宿主细胞BJ 5183以及腺病毒包装细胞(293细胞)均购自美国STRATAGENE公司。
本发明所涉及的核酸序列和用于实现本发明的其他核酸，包括RNA、cDNA、基因组DNA、载体均可从各种来源中分离得到并可经受遗传操作、扩增，和/或被重组表达。
另外，也可以使用已知的化学合成技术体外合成这些(单链)核酸(例如参见Adams，J.Am.Chem.Soc.105661，1983；Belousov，Nucleic Acids Res.253440-3444，1997；Blommers，Biochemistry 337886-7896，1994；Narang，Meth.Enzymol.6890，1997)。然后再合成其互补链并在适当条件下将它们一起退火。或者使用DNA聚合酶，将互补链与适当的引物序列加合，以得到所需的双链DNA片段。
核酸操作技术，例如亚克隆、探针标记、测序、杂交等在科学文献和专利文献都已有充分描述(如参见Sambrook，ed.Molecular CloningA LaboratoryManul(2nd.ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory(1998)；CurrentProtocols In Molrcular Biology，Ausubel，ed.John wiley & Sons，Inc.NewYork(1997))。
可以使用许多已知的方法完成核酸、载体、多肽和蛋白质等的定性和定量分析，例如这些方法包括分光光度法、放射显影法、电泳、高效液相层析(HPLC)、免疫沉淀、免疫扩散、免疫电泳、放射免疫、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光试验、Southern分析、Northern分析、点印迹分析、凝胶电泳(SDS-PAGE)、RT-PCR、定量PCR、其他核酸或靶或信号扩增技术等。
我们的实验结果显示，本发明的携带LMP2编码序列的复制缺陷型重组腺病毒具有高达109pfu/ml的病毒滴度。用本发明的重组腺病毒感染小鼠后，可检测(免疫荧光法)到动物体内特异性抗体的生成，并且可检测(LDH方法)到动物的特异性细胞毒反应。
事实上，大量的实验室研究已经证明，经肌肉注射、皮下注射或微粒(如胶体金包被载体)轰击等免疫途径接种的病毒疫苗后，被免疫的人或动物不仅可表达由之编码的蛋白质，进而在动物体内诱发抗体生成反应(通常是通过Th2途径)，而且可诱发包括I和II类MHC限制的CD+CTL和CD4+辅助细胞(Th1)免疫在内的细胞免疫反应(Fu，TM.etal.，J.Viral.712715-2721，1997；Lekutis，C.etal.，J.Immunol.，1584471-4477，1997；Wang R.，et al.，Science 282476-480)。
无论是用于免疫预防还是用于免疫治疗，其目的都是为了在体内诱导产生保护性抗体和/或细胞毒性淋巴细胞，以通过不同的免疫机制发挥其抑制EB病毒相关肿瘤发生和发展的目的。既然本发明的重组腺病毒疫苗可在体内诱发体液免疫反应，就有可能利用所说的重组DNA作为免疫原，借助某些已知的表达、转录或加工机制和相应元件，在宿主动物体内可调控地表达由所说的重组病毒DNA编码的相应的具有天然构象的蛋白质。
这就是说，通过直接肌肉内注射、皮内注射、微粒轰击甚至口服途径给宿主动物投用携带于适当载体如腺病毒载体上的编码特定蛋白质如LMP2蛋白的核苷酸序列，即可在宿主体内有效地复制所说的重组病毒DNA，并表达由之编码的抗原蛋白质，进而刺激宿主免疫系统，以诱导抗这些潜在的病原体抗原如特异性病毒蛋白或靶特异性蛋白质的免疫反应。
根据本发明，所说的编码特定蛋白质的核苷酸序列可以是编码任何病毒、细菌或寄生虫蛋白质的核苷酸序列，或者是编码任何肿瘤相关抗原或致癌基因的核苷酸序列，也可以是编码B或T细胞相关CD分子的核苷酸序列。
例如，仅就肿瘤治疗而言，当从某些肿瘤组织中找到并克隆了肿瘤相关的特异性序列(即肿瘤相关基因，例如突变的P53基因、鼻咽癌相关LMP2等)后，可按本发明的方法以相关蛋白质的编码序列作为免疫原，在适当的载体携带下接种人或哺乳动物以在体内诱导抗相应肿瘤的体液和细胞免疫反应。或者，也可以使用所说的DNA免疫原制备抗由之表达的抗原蛋白质的单克隆抗体，并可以将这样的单克隆抗体直接用于治疗目的。或者，亦可将所说的单克隆抗体连接到毒素分子或其部分上，制成以单克隆抗体为导向部分的靶特异性细胞毒性剂(嵌合毒素)。可以制备抗T淋巴细胞表面膜上CD2(T11)、CD3、CD4、和CD8等抗原，以及抗B淋巴细胞表面膜上CD10、CD19和CD20等抗原的单克隆抗体，并可使用这些抗体与毒素分子融合得到的杂交蛋白质作为靶特异性免疫毒性剂，用于治疗移植物抗宿主反应、器官移植排斥、I型糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮及重症肌无力等由T细胞引起的自身免疫病。
因此，本发明的再一个目的是提供一种基本上由如上限定的携带LMP2编码序列的复制缺陷型重组腺病毒，以及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的疫苗组合物。
根据本发明应用的一个优选实施方案，其中所说的复制缺陷型重组腺病毒的病毒滴度不小于109pfu/ml。
根据本发明应用的一个优选实施方案，其中所说的复制缺陷型重组腺病毒可在体内诱导抗EB病毒LMP2蛋白特异性抗体反应和EB病毒特异性细胞毒性淋巴细胞反应。
可按照制药工业中已知的方法(如参见Remington’s PharmaceuticalScience.15th ed.，Mack Publishing Company，1980)将如上限定的携带LMP2编码序列的复制缺陷型重组腺病毒与一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂或稀释剂按适当的比例混合，并按已知方法除菌后制备本发明的疫苗组合物。
根据给药途径的不同，可将本发明的疫苗组合物配制成适于静脉内、肌肉内、体腔内、组织内、皮内或皮下给药的可注射的溶液剂或分散剂；或适于口服给药的粉末剂、片剂、颗粒剂、丸剂、乳剂、悬浮剂、胶囊剂、酏剂；或适于局部给药和通过皮肤或粘膜吸收给药的喷雾剂、霜剂、乳剂、软膏剂、凝胶剂等。
为了制备适于胃肠道外途径给药的可注射溶液剂，例如可以使用无菌蒸馏水、注射用水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、以及含有乙醇、多元醇(如乙二醇、丙二醇及液态聚乙二醇等)的溶剂或分散介质作为载体或稀释剂。在任何情况下，所说的可注射制剂均应是无菌和可流动并适于通过注射器注射给药的。另外，在生产、运输和储存条件下，所说的制剂还必须是稳定的，并能够对抗细菌和真菌等微生物的污染。
另外，也可使用制药工业中已知的方法和辅助成份，将本发明的疫苗组合物制成微胶囊剂或脂质体包裹剂。
为了制备适于外用或局部给药的制剂，例如可以将槐定碱或其衍生物或类似物溶解于含水介质或其他适当的载体或基质中，并与适当的透皮透黏膜吸收剂混合，制成喷雾剂或气雾剂。另外，也可使用适当的基质或赋形剂将本发明的疫苗组合物制成适于局部或通过皮肤或粘膜吸收给药的乳剂、霜剂、软膏、凝胶剂或栓剂。
另外，虽然本发明的疫苗可以通过胃肠道外途径或胃肠道途径给药，但我们的动物接种(比较)实验显示，胃肠道外途径接种可比经胃肠道途径接种获得更好的免疫效果。推测这可能与经胃肠道途径接种造成胃酸对病毒破坏，以及肠淋巴组织对抗原缺乏敏感性等因素有关。
最后应特别指出的是，作为另一种常用的接种方法，也可以将所说的病毒固定于载体上，制成微颗粒如胶体金包被的载体微粒，以微粒轰击方法接种于被免疫宿主体内。
下列实施例旨在进一步举例说明而不是限制本发明。应明确指出的是，在不违背本发明的精神和原则的前提下，对本发明的个别非必要技术特征所作的任何改动和改变都将落入本发明的待批权利要求范围内。另外，如前所述，由于用于实现本发明的核酸序列，包括RNA、cDNA、基因组DNA、载体或相关病毒等起始材料均是已知的，可从各种来源直接得到或者可经受遗传操作、扩增，和/或重组表达等方法间接得到，并且本说明书的详细描述部分和相关实施例部分也已对本发明的方法作了完整、清楚的描述，所以申请人相信本领域技术人员在仔细阅读了本说明书后完全可以重复和再现本发明。
实施例实施例1EBV-LMP2重组腺病毒的构建以下按分步骤详细描述EBV-LMP2重组体腺病毒的构建流程(参见图2)。
1、EBV-LMP2重组腺病毒穿梭质粒的构建
(1)大肠杆菌感受态细胞的的制备首先将大肠杆菌DH5α/DH10B细胞接种于不含抗生素的LB培养基(3ml)中，37℃过夜后再将1∶100稀释的此培养物转入新的同样培养基中继续培养约2.5小时，直至OD600达到0.6左右。然后离心(4℃，4000rpm，10分钟)收集细胞并反复(2次)用的0.1M CaCl2(10ml)溶液洗涤后重新悬浮细胞。再次离心并将致敏的感受态细胞悬浮在小体积(2ml)0.1M CaCl2溶液中，-70℃保存备用。
(2)质粒的小量制备、酶切和电泳分析及去磷酸化为了小量制备携带LMP2基因和氨卞青霉素抗性的质粒pSG5-LMP2(美国哈佛大学赠送)，首先按已知方法用质粒(1μl)转化如上致敏的大肠杆菌细胞(将质粒与细胞的混合物冰浴30分钟、热休克90分钟后加入不含抗生素的培养基并保温，然后铺板)。转化并培养过夜后从平板上挑选单个菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中并震荡(37℃)培养过夜。过夜培养后，离心收集细胞并向细胞沉淀物中加入溶液I(50mM葡萄糖，25mMTris-HCL(pH8.0)和10mMEDTA(pH8.0))(100μl)以震荡悬浮细胞。然后再加入新鲜配制的溶液II(0.2N NaOH，1％SDS)(200μl)并冰浴3分钟。最后再加溶液III(100ml中含60ml5M乙酸钾，11.5ml冰乙酸，28.5ml水)(150μl)并冰浴5分钟。处理后离心(12000rpm，10分钟)收集上清并用等体积苯酚和氯仿混合溶剂以及单纯的氯仿各抽提一次，取分离面上层水相，加入2倍体积的无水乙醇-20℃沉淀2小时再用70％乙醇洗涤。离心(12000rpm，3分钟)并加入含RNase A(100μg/ml)的TE溶液(30μ)l溶解沉淀后，-20℃保存备用。
按照供应商提供的条件，用限制性内切酶EcoRI消化如上小量制备的质粒pSG5-LMP2和Bluescript，然后分别用1％琼脂糖凝胶电泳分离两种酶切产物。为此，用3倍体积的溶胶液溶化凝胶后，按比例加入适当体积(见使用说明书)的玻璃奶冰浴10分钟，离心(12000rpm，30秒)并反复漂洗沉淀后，置于37℃温箱干燥15～20分钟，加入TE(50μl)并于60℃下水浴5分钟，再次离心并回收上清，以电泳法估计产物的收率及纯度。
在10×碱性磷酸酶缓冲液(2μl)中，用碱性磷酸酶(0.5μl)处理(55℃水浴45分钟)如上得到的载体DNA(10μl)。向反应体系中加入1/10体积的0.5M EDTA(PH8.0)(2μl)并于65℃下灭活1小时，然后依次用等体积饱和苯酚/氯仿和氯仿/异戊醇各抽提一次。收集上层水相并加入1/2体积醋酸铵(7.5mol/L)，然后用2倍体积无水乙醇-70℃沉淀30分钟。离心(12000rpm，15分钟)收集如此去磷酸化的DNA沉淀，用70％乙醇洗涤一次并干燥后，加水稀释至DNA浓度为0.5μg/μl，于-20℃下保存备用。
(3)重组中间质粒的构建和酶切鉴定将去磷酸化的载体Bluescript M13的酶消化片段与回收的目的基因(LMP2基因)片段按1∶5比例混合，45℃水浴5分钟后迅速置于冰浴中，加入10×T4DNA连接酶缓冲液和T4DNA连接酶(总反应体积10μl)，16℃过夜连接。然后，用所得到的连接反应混合物转化致敏的大肠杆菌DH5α细胞。
以碱裂解法提取如上得到的中间质粒Bluescript-LMP2，分别用单一EcoRI、SalI酶消化和KpnI-Xbal双酶消化，根据酶切片段的大小判定重组质粒的大小和方向。酶切分析表明，正向插入且不存在串联现象的重组体经SalI酶消化后得到两条大小分别为788bp和4128bp的片段，而反向插入外来片段的重组体则得到两条大小分别为1169bp和3748bp的片段。然后用玻璃奶回收KpnI-Xbal双酶消化的LMP2片段。经EcoRI单一酶和KpnI-Xbal双酶消化后所得到的片段大小分别为2960和2000bp。(所使用的内切酶均购自日本TAKARA公司)(4)重组腺病毒穿梭质粒的构建分别KpnI-Xbal用双酶消化带有CMV启动子的穿梭质粒pShuttle-CMV和带有CMV启动子和绿色荧光蛋白的质粒pAdTrack-CMV。然后将所回收的片段与KpnI-Xbal双酶切的LMP2片段按1∶4比例混合。45℃水浴5分钟后迅速置于冰浴中，加入10×T4DNA连接酶缓冲液和T4DNA连接酶(反应体积40μl)，16℃过夜连接。取5μl连接反应物转化致敏的DH10B细胞。然后小量制备质粒并分别进行酶消化，根据酶切片段的大小鉴定连接产物。酶切分析显示，经EcoRI单酶消化和KpnI-Xbal双酶消化后，前者裂解成两条大小分别为7452bp和2000bp的片段；后者裂解成两条大小分别为9220bp和2000bp的片段。表明所得产物为正确连接的重组穿梭质粒pShuttle-LMP2和pAdTrack-LMP2(参见图1)。
2、EBV-LMP2重组腺病毒的构建(1)穿梭质粒和骨架质粒DNA的制备以碱裂解法从宿主细胞中提取携带LMP2之编码序列的穿梭质粒，用PmeI单酶消化后回收酶切片段，-20℃下保存备用。
同时，挑取单个含pAdEasy-1质粒的细菌菌落，接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃下震荡培养24小时。将培养物冰浴10分钟后离心收集细菌细胞。依次加入上述的溶液I、溶液II和溶液III并进行相似处理后离心(12000rpm、10分钟)收集上清。用等体积异丙醇-20℃沉淀过夜后，用70％乙醇反复洗涤沉淀2-3次。然后加入含RNaseA(100μg/ml)的TE溶液(30μl)溶解沉淀，完全溶解后于-20℃下保存备用。
(2)大肠杆菌BJ5183宿主细胞的制备将大肠杆菌BJ5183细胞接种于含链霉素(30μg/ml)LB培养液(3ml)中，37℃保温过夜后再将1∶1000稀释的此培养物转入新的含链霉素LB(200ml)中继续培养4～5小时，直至OD550达到0.8左右。离心(4℃、3000rpm、10分钟)收集细胞后再用体积冰预冷的WB溶液(10％甘油，90％的去离子水)重新悬浮细菌细胞。用WB溶液反复洗涤3次后-70℃下保存备用。
(3)BJ5183细胞的转化和腺病毒重组体的生产与鉴定向上述PmeI线性化的穿梭质粒(携带卡那酶素抗性)各6μl中分别加入腺病毒骨架质粒pAdEasy-1(1μl)。将如上得到的BJ5183细胞(20μl)置于无水乙醇浸泡处理并预冷却的电转化仪(Bio-Rad)的小杯中，在2500V，200Ω，25μFD条件下进行电转化。然后，快速加入不含抗生素的SOC培养液(参见《分子克隆》第---章)0.5ml重新悬浮细胞。37℃保温10分钟后将被转化的细胞接种于4个卡那霉素阳性的LB培养皿中(100μl/皿)，37℃培养过夜。
培养后，挑选最小的10～20个克隆，接种于2ml卡那霉素阳性(25μg/ml)的LB培养液中，继续于37℃下振摇过夜。然后用碱裂解法提取质粒，并进行EcoRI和PacI单酶切鉴定。用鉴定正确的重组体转化DH10B感受态细胞，碱裂解法提取质粒并于-20℃下保存备用。
所得到的重组体经EcoRI酶切后，得到两条大小分别为2000bp和15kb以上的片段；并且经PacI酶切后，得到两条大小分别为大约30kb和3000-4500kb的片段。因此，限制性酶切分析结果表明穿梭质粒和骨架质粒已在宿主细胞内重组酶的介导下发生了同源重组，并且宿主细胞也获得了卡那酶素抗性。
3、重组腺病毒的包装
(1)重组腺病毒DNA的制备用7％琼脂糖凝胶电泳分离PacI酶切的重组腺病毒质粒(1～4μg)，切下含有目的条带的琼脂糖凝胶备用。
用透析袋夹将预先在2％(w/v)碳酸氢钠和1mmol/L EDTA(PH8.0)中煮沸(10分钟)处理过的透析袋一端封住，充入1×TAE电泳液和琼脂糖凝胶进行电泳，直到将DNA从凝胶中洗脱出来。然后将缓冲液转移至1.5ml的离心管中并加入1/10体积3mol/L醋酸钠。用2倍体积无水乙醇-20℃沉淀DNA过夜，并离心收集DNA沉淀。再用70％乙醇洗涤并干燥后，加水至DNA浓度为0.2μg/μl备用。
(2)重组腺病毒的包装将A液[(DNA溶液(PacI酶切重组腺病毒质粒后得到的大片段)20μl(1～4μg))加Opti-MEM培养液(GIBCO BRL)共100μl]和B液[Lipofectamine试剂(GIBCO BRL)20μl加Opti-MEM培养液共100μl]轻轻混匀作为转染液，并于室温下放置40分钟。取0.8ml Opti-MEM培养液与转染液混匀后轻轻加到预培养的293细胞(2×106)上，于37℃和5％CO2环境下保温4小时以在293细胞之E1蛋白的帮助下实现病毒的包装(参见图1)。然后加入含10％小牛血清的DMEM完全液(6ml)，继续保温过夜后换液观察荧光蛋白的表达。
转染后7～10天，刮取并离心(800rpm，5分钟)收集细胞，然后将细胞重新悬浮于PBS(2ml)中。于-70℃和37℃下反复冻融4次后，离心(800rpm，5分钟)收集上清。用1ml上清接种293细胞并保温(37℃，5％CO2)1小时。然后加入含2％小牛血清的DMEM维持液(6ml)并观察细胞病变。
观察结果可见，被转染的细胞有荧光蛋白表达并且出现细胞肿胀和圆缩等细胞病变。
实施例2EBV-LMP2重组腺病毒的鉴定和病毒滴度分析(1)病毒DNA的PCR检测使用如上在293细胞中传代增殖的并在蛋白酶K纯在下加热并煮沸的病毒上清(2μl)作为模板，并使用上游引物P15’CGGGATCCATATGCTTTTAACATTGGCAGC’；和下游引物P25’CGGGATCCAGTGTAAGGCAGTAGTAG3’进行30次PCR扩增循环。然后对扩增的病毒DNA进行电泳分析。结果显示只有重组腺病毒DNA中有长度为520bp的LMP2特异性扩增条带。
(2)被感染的细胞内LMP2 DNA基因的存在收集如上得到的重组腺病毒和腺病毒野毒株，分别感染293细胞。裂解细胞后用常规方法提取细胞染色体DNA。同时，制备地高辛标记探针并用以标记编码LMP2的特异性DNA片段。然后在杂交条件下，使地高辛探针标记的LMP2特异性DNA片段与如上制备的被感染细菌细胞的染色体DNA杂交。样品在硝酸纤维素膜上杂交后，以免疫显色法检测特异性杂交斑点的存在。结果可见，被本发明的重组腺病毒(rAd-LMP2)感染之293细胞的染色体DNA可与地高辛探针标记的LMP2特异性DNA片段杂交，而被野生型腺病毒(Ad5)感染之293细胞的染色体DNA则不与地高辛探针标记的LMP2特异性DNA片段杂交。
(3)重组腺病毒感染的293细胞中LMP2基因的转录收集如上得到的重组腺病毒(rAd-LMP2)和腺病毒野毒株(Ad5)并分别感染293细胞。裂解细胞后用常规方法提取细胞总RNA。对所得到的细胞RNA进行反转录反应，然后以反转录产物为模板进行PCR扩增。用1％琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物后，对所得到的片段进行反转录酶-聚合酶链式反应检测。结果可见，使用LMP2特异性引物从两种重组腺病毒感染的细胞中扩出一条520bp的条带，而野生型腺病毒(Ad5)感染的细胞中没有出现相应的扩增条带(参见图3)。此结果从RNA水平上进一步证实了LMP2基因在细胞中得以有效转录。
(4)重组腺病毒感染的293细胞中LMP2的表达以LMP2特异性单克隆抗体14B7，17F9，4E11为第一抗体(英国伯明翰大学赠送)，并以辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠IgG(北方同正试剂公司)为第二抗体，对细胞样品进行免疫引迹分析(Western-blot)。结果表明，rAd-LMP2感染的293细胞中显示有大约54KD的蛋白带，而Ad5感染的细胞中没有出现相似大小的带(参见图4)。
(5)重组腺病毒滴度的测定用本发明的重组腺病毒感染293细胞，37℃和5％CO2环境下将细胞孵育1小时，然后加入含2％小牛血清的DMEM维持液继续保温，3～4天后待细胞出现典型病变时收获细胞。反复冻融(4次)后离心(12000rpm，30分钟)并过滤上清液即得到所需的病毒原液。
将此病毒原液作梯度稀释，以10-4～10-9稀释度各2ml接种于六孔板上的Hela细胞，保温15小时后在荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达并按下列公式计算病毒滴度病毒滴度(pfu/ml)＝平均每孔荧光数×稀释倍数/接种毫升数结果可见，本发明的重组腺病毒滴度不小于109pfu/ml。
实施例3EBV-LMP2重组腺病毒的免疫学活性分析常规培养DBA肥大细胞瘤细胞(H-2d)(P815细胞)。当细胞生长到对数中期时(1×107/ml)收获细胞，并在1000V/cm电压和20-100ms冲击条件下以电转化法用携带LMP2基因序列的重组质粒转染之。转染后，用含10％牛血清的完全培养基37℃培养24小时，然后换成含600μg/ml G418的选择培养基继续。两周后得到有稳定抗性的阳性细胞。继续扩增培养后，将其用作靶细胞。
4～5周龄Balb/c(H-2d)雌性小鼠随机分为6组，每组8只。乙醚麻醉下，按每只动物107pfu的剂量经肌肉注射、滴鼻和灌胃途径三种不同的途径分别用本发明的重组体腺病毒(rAd-LMP2)和野生型腺病毒(Ad5)免疫动物。第4周加强免疫一次。第6周采血并分离血清进行抗体检测，然后处死动物分离脾细胞进行CTL活性分析。
(1)EBV-LMP2重组腺病毒诱发的小鼠LMP2特异性抗体生成使用P815-LMP2抗性细胞涂片作为阳性抗原片，以常规间接免疫荧光法检测被免疫小鼠血清内抗LMP2特异性抗体的存在及其滴度。结果如下列表1中所示。
表1被免疫Balb/c小鼠血清中LMP2抗体的检测
从表1所示的结果可以看出，无论使用何种给药途径，接种本发明的携带EB病毒LMP2蛋白之DNA编码序列的复制缺陷型重组腺病毒均可诱导被免疫动物产生抗LMP2蛋白的特异性抗体反应。与经胃肠道途径相比，似乎经非胃肠道途径可获得更好的免疫效果。
(2)EBV-LMP2重组腺病毒诱发的小鼠LMP2特异性CTL反应使用吸附了携带LMP2蛋白之DNA编码序列的重组反转录病毒的正常同龄Balb/c(H-2d)小鼠脾淋巴细胞作为刺激细胞，使用被免疫小鼠的脾淋巴细胞作为效应细胞，并使用P815-LMP2抗性细胞作为靶细胞，以乳酸脱氢酶法检测接种了本发明的重组腺病毒之小鼠的LMP2特异性细胞毒性淋巴细胞(CTL)活性(％杀伤率)。结果如下列表2中所示。
表2 免疫小鼠产生的LMP2特异性CTL平均活性(杀伤率％)
从表1图5所示的结果可以看出，无论使用何种给药途径，接种本发明的携带EB病毒LMP2蛋白之DNA编码序列的复制缺陷型重组腺病毒均可诱导被免疫动物产生CTL反应。效∶靶＝100∶1时，效应细胞对靶细胞的杀伤率约为30％～50％，显然高于接种野生病毒的对照组。而且与经胃肠道途径相比，似乎经非胃肠道途径可获得更好的免疫效果。


本发明涉及复制缺陷型重组腺病毒，特别是涉及携带EB病毒潜伏膜蛋白2的DNA编码序列的复制缺陷型重组腺病毒及其制备方法。本发明进一步涉及所说的复制缺陷型重组腺病毒或其组合物在生产用于预防和治疗EB病毒相关肿瘤的疫苗中的应用。