专利名称：一种基于金纳米壳包覆高分子微囊的治疗诊断制剂及其制备方法传统临床应用中，诊断和治疗是两个独立的过程，诊断用试剂和治疗用试剂也是两种独立的药物。在这种情况下，患者往往需要接受两次医疗过程一先诊断，再治疗一而且中间往往间隔时间较长，常常贻误了治疗疾病的最佳时期。另外，诊断用和治疗用试剂往往都对患者有一定的副作用，分为两次用药会增大患者不必要的痛苦和风险。为了解决这种情况，近年来临床医生和科研工作者合作，将诊断和治疗结合起来作为一个连续的医疗过程，大大提高了效率。同时也有研究者将诊断用药和治疗用药复合在一起，得到诊断-治疗联用试剂，一次用药就可完成从诊断到治疗的全过程，减少了病人出现毒副作用的风险和对身体可能造成的不必要的伤害。光热治疗是一种较好的治疗肿瘤的手段。它使用光吸收剂和对于人体组织穿透力较强的红外光来进行选择性治疗。然而，临床使用前我们需要准确知道病变位置，治疗过程中我们也需要实时监控治疗进程，治疗完成后我们也需要尽快评价治疗效果以确定下一步治疗方案。这些工作正好可以通过医学超声成像手段解决。超声成像是一种临床应用十分广泛的无创快速诊断技术，具有实时、低价、无辐射、操作简便等特性，同时借助于具有回声增强效果的超声造影剂，超声诊断的准确性和灵敏度大大提高。因此，我们将用于超声诊断的超声造影剂和用于光热治疗的金纳米壳结合在一起，得到一种基于金纳米壳包覆高分子微囊的治疗诊断制剂，它同时具有超声造影诊断和光热治疗功能，使我们可以只需要用一种复合制剂即可同时实现诊断和治疗两种功能，从而减少中间环节，大大提高了诊断-治疗效率，具有很好的临床应用潜力。
本发明的目的是为了得到一种同时具有超声造影诊断和光热治疗功能的诊断-治疗联用制剂，解决传统临床实践中诊断或治疗单一使用带来的种种不便，用一种复合制剂同时实现诊断和治疗两种功能。为达到上述目的，本发明采取以下措施，制备一种基于金纳米壳包覆高分子微囊的治疗诊断制剂，该制剂为核壳结构，内核为高分子微囊，直径为0. I 10微米，外壳为金纳米壳，厚度为I 500纳米。它的制备方法包括如下步骤(I)采用双乳法制备水包油包水型高分子微球；(2)在高分子微球表面修饰金纳米粒子；(3)采用引晶法以微球表面的金纳米粒子为晶种，通过盐酸羟胺原位还原氯金酸得到包覆在微球表面的金纳米壳，使其具有吸收红外光辐射并转化为热能的功能；(4)采用真空冷冻干燥法将内核高分子微球中分散的内水相升华，得到具有许多微孔的高分子微囊，使其具有超声造影增强效果。本发明中制备高分子微囊所使用的高分子材料包括明胶、葡聚糖、白蛋白、壳聚糖、聚乙交酯、聚丙交酯、聚乙交酯丙交酯共聚物、聚丙交酯乙交酯共聚物、聚乙内酯、聚羟丁酸等。本发明方法中在高分子微球表面修饰金纳米粒子的方法包括共价结合、静电吸附、氢键作用、配位结合等作用力。本发明中所用的作为晶种的金纳米粒子的直径为I 100纳米，所使用的还原剂盐酸羟胺的浓度为1 10000mmol/L，所用的氯金酸的浓度0. 0001 10% (质量体积比)。本发明方法中所用对于金纳米壳包覆高分子微囊进行真空冷冻干燥的条件为真空度0. I IOOPa ;温度-10°C -100°C ;时间I 500小时。本发明具有以下优点本发明的优点之一是金纳米壳包覆高分子微囊的制备条件简单而温和。本发明的优点之二是制备金纳米壳包覆高分子微囊的材料具有很好的生物相容性，高分子材料选用可生物降解的无毒的药用辅料，同时金纳米材料也被证明具有很好的生物相容性。本发明的优点之三是制备得到的金纳米壳包覆高分子微囊这种治疗诊断制剂为冻干粉剂，易于储存。本发明的优点之四是将诊断和治疗过程合二为一，化繁为简，节省时间，增加效率。图I为本发明的制备方法示意图(I-水包油包水高分子微球，2-表面修饰金纳米粒子的高分子微球，3-金纳米壳包覆的高分子微球，4-冻干后金纳米壳包覆的高分子微球，5-内水相，6-金纳米粒子，7-金纳米壳，8-冻干后的微孔)。图2为一得到的金纳米壳包覆高分子微球治疗诊断制剂的扫描电子显微镜照片(呈规则的球形，粒径从几百纳米到几微米不等)。图3为二得到的金纳米壳包覆高分子微球治疗诊断制剂的紫外-可见吸收光谱图(从图中可以看到复合材料在650nm 850nm范围内有较宽吸收峰，说明其对近红外光有较好的吸收效果)。图4为注射
二得到的金纳米壳包覆高分子微球治疗诊断制剂的兔肾脏反向谐波成像造影图。图5为没有注射
二得到的金纳米壳包覆高分子微球治疗诊断制剂的兔肾脏反向谐波成像造影图。图6为
三得到的金纳米壳包覆高分子微球治疗诊断制剂对于人宫颈癌细胞的杀伤效果比较(I-培养基培养，不用激光照射；2-培养基培养，用激光照射；3-加入复合材料培养，不用激光照射；3_加入复合材料培养，并用激光照射。可以看到金纳米壳包覆的高分子微球复合材料只有在近红外激光照射下才会对肿瘤细胞有杀伤作用)。

本发明技术方案不局限于以下所列举
，还包括各
间的任意组合。

一(I)称取500mg聚丙交酯于快速搅拌下溶解于IOmL二氯甲烷中，待完全溶解后，力口A ImL去离子水，使用探头超声仪在300W功率下处理30s，形成初级水包油微乳，然后将得到的初级微乳逐滴滴加到预冷的5%聚乙烯醇溶液中，用高速分散均质机在9500rpm匀化5min后磁力搅拌3h,使二氯甲烧挥发后,5000g离心5min,收集沉淀在同样的离心条件下水洗后，即得到水包油包水高分子微球；(2)取20 ii L微球悬液加入20mL lmg/mL的聚烯丙基胺盐酸盐，吸附15min后，5000g离心5min,收集沉淀并在同样的离心条件下水洗,再加入朽1檬酸钠稳定的直径2. 6nm的金纳米颗粒，同样重复吸附-离心-洗涤过程，即得到表面修饰金纳米粒子的高分子微球。(3)将得到的表面修饰金纳米粒子的高分子微球加入40mL 0.01%的氯金酸溶液中搅拌混勻，再加入新配制的40mmol/L盐酸轻胺2mL,搅拌反应30min后,5000g离心5min,收集沉淀在同样的离心条件下水洗即可得到金纳米壳包覆的高分子微球。(4)使用真空冷冻干燥机在_54°C，真空度5Pa条件下冻干36小时，即可得到金纳米壳包覆的高分子微囊。

二 (I)称取300mg聚乙交酯丙交酯共聚物于快速搅拌下溶解于IOmL 二氯甲烷中，待完全溶解后，加入ImL去离子水，使用探头超声仪在IlOW功率下处理60s，形成初级水包油微乳，而后将得到的初级微乳逐滴滴加到预冷的5%聚乙烯醇溶液中，用高速分散均质机在IOOOOrpm勻化5min后磁力搅拌2h,使二氯甲烧挥发后,5000g离心5min,收集沉淀在同样的离心条件下水洗后，即得到水包油包水高分子微球；(2)取IOii L微球悬液加入15mL lmg/mL的聚烯丙基胺盐酸盐，吸附IOmin后5000g离心5min,收集沉淀并在同样的离心条件下水洗,再加入朽1檬酸钠稳定的直径13nm的金纳米颗粒，同样重复吸附-离心-洗涤过程，即得到表面修饰金纳米粒子的高分子微球。(3)将得到的表面修饰金纳米粒子的高分子微球加入36mL 0.01%的氯金酸溶液中搅拌混勻，再加入新配制的40mmol/L盐酸轻胺I. 5mL,搅拌反应45min后，5000g离心5min,收集沉淀在同样的离心条件下水洗即可得到金纳米壳包覆的高分子微球。(4)使用真空冷冻干燥机在_46°C，真空度5Pa条件下冻干48小时，即可得到金纳米壳包覆的高分子微囊。(5)将新西兰大白兔常规麻醉后，经兔耳缘静脉匀速推注本实施方式得到的金纳米壳包覆的高分子微囊悬液(40mg/mL,0. 04ml/kg),使用Philips IU22超声诊断仪，以脉冲转化模式，L9-3探头，MI 0. 42进行回波成像，用超声仪内部工作站存储动静态造影资料，并经计算机转为数字信号，测试结果如图4所示，从图3中可以看出经造影增强显影后，大白兔肾脏等实质脏器及血流信号明显增多、增强，可获得比未造影前更多的血流信息。整个造影过程，大白兔生命征平稳，造影后无不良反应，表现出良好的安全性。没有注射本实施方式得到的金纳米壳包覆的高分子微囊悬液的成像造影图如图5所示，从图中可以看出图像中显示的血流信号少且弱，可得到的血流信息较少。这一结果说明本实施方式得到的金纳米壳包覆的高分子微囊仍然具有很好的超声造影成像的功能。

三(I)称取500mg聚丙交酯于快速搅拌下溶解于20mL 二氯甲烷中，待完全溶解后，加A ImL去离子水，使用探头超声仪在IlOW功率下处理30s，形成初级水包油微乳，而后将得到的初级微乳逐滴滴加到预冷的5%聚乙烯醇溶液中，用高速分散均质机在9000rpm匀化7min后磁力搅拌2. 5h,使二氯甲烧挥发后,5000g离心5min,收集沉淀在同样的离心条件下水洗后，即得到水包油包水高分子微球； (2)取20 ii L微球悬液加入20mL 2mg/mL的聚烯丙基胺盐酸盐，吸附15min后5000g离心5min,收集沉淀并在同样的离心条件下水洗,再加入朽1檬酸钠稳定的直径2. 6nm的金纳米颗粒，同样重复吸附-离心-洗涤过程，即得到表面修饰金纳米粒子的高分子微球。(3)将得到的表面修饰金纳米粒子的高分子微球加入36mL 0.01%的氯金酸溶液中搅拌混勻，再加入新配制的40mmol/L盐酸轻胺I. 5mL,搅拌反应30min后，5000g离心5min,收集沉淀在同样的离心条件下水洗即可得到金纳米壳包覆的高分子微球。(4)使用真空冷冻干燥机在_54°C，真空度5Pa条件下冻干48小时，即可得到金纳米壳包覆的高分子微囊。(5)将人宫颈癌细胞按照5X IO5个/孔接种到6孔板中，加入培养基培养24h，然后加入0. 3mg/mL的金纳米壳包覆的高分子微囊培养基悬液2mL，再培养lh，使用波长为808nm的二极管红外激光器在8W/cm2的辐照强度下照射10分钟，用钙黄绿素-AM染色后，显微镜观察。从图6可以看到，只有加入了金纳米壳包覆的高分子微囊这种复合材料后，在激光照射的位置才会有暗斑，说明此处的细胞都被杀死。反之，无论是单独加入金纳米壳包覆的高分子微囊或者单独激光照射的细胞都完全存活，说明本实施方式得到的金纳米壳包覆高分子微囊的治疗诊断制剂是无毒的，只有在与激光共同作用时才具有光热治疗杀死肿瘤细胞的功能。


本发明涉及一种基于金纳米壳包覆高分子微囊的治疗诊断制剂及其制备方法，所制备得到的金纳米壳包覆的高分子微囊同时具有超声造影诊断和光热治疗的功能，成功地将超声造影诊断的实时、高效、低价、无辐射等特性，和近红外光热治疗的高选择性、高疗效结合在一起，摒弃了诊断或治疗单一使用的传统观念，只用一种复合试剂即可同时实现诊断和治疗两种功能，从而减少了中间环节，大大增加了诊断-治疗效率，具有很好的临床应用潜力。