专利名称：人组织激肽释放酶的微囊化细胞及其微囊化方法和应用的制作方法 组织激肽释放酶是丝氨酸蛋白酶家族的一员，可以裂解低分子量激肽原产生具有生物活性的激肽(文献1Clements J.A.The glandular kallikrein family ofenzymestissue-specific expression and hormonal regulation，Endocrine Rev.，1989；10393-419.；文献2Bhoola K.D.，C.D.Figueroa，K.Worthy，Bioregulationof kininskallikreins，kininogens，and kininases，Pharmacol.Rev.，1992；441-8)；激肽与B2受体结合后可以引发一系列生物学活性，如平滑肌收缩与舒张，电解质平衡，葡萄糖转运，痛觉生成，炎症形成，血管通透性增加，血压下降等(文献2Bhoola K.D.，C.D.Figueroa，K.Worthy，Bioregulation of kininskallikreins，kininogens，and kininases，Pharmacol.Rev.，1992；441-8)。临床研究发现组织激肽释放酶水平与血压水平成反相关(文献3Margolius HS，D.Horwitz，J.J.Pisano，H.R.Keiser，Urinary kallikreinexcretion in hypertensive man，Relationships tosodium intake andsodium-retaining steroids，Circ Res.，1974；35820-825)。Dahl盐敏感大鼠给予高盐负荷后，发生高血压及肾功能损伤，组织激肽释放酶可以降低Dahl大鼠的血压水平，逆转盐诱导的肾小球硬化和肾小管损伤，改善肾脏功能(文献4Willam C.Wolf，Hideaki Yoshida，Jun Agata，Lee Chao，Human tissuekallikrein gene delivery attenuates hypertension，renal injury，and cardiac remodeling inchronic renal failure，Kidney International，200058730-739)。但由于血管系统中组织激肽释放酶抑制剂的存在和蛋白酶对激肽的降解作用，为了达到治疗水平的血药浓度必须采取持续不断的给药方式(文献5Chao J，Chai K.X.，Chen L.M.，Xiong W.，Tissue kallikrein-binging protein is a serpinpurification，charaxterization，anddistribution in normotensive and spontaneously hypertensive rats，J.Biol Chem.，1990；26516394-16401)。人组织激肽释放酶在人体液中含量较低，提取纯化过程复杂，难以满足临床需求。
本发明的目的是提供一种适于实际应用和临床需要的人组织激肽释放酶的微囊化细胞及其微囊化方法和应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为基因修饰的表达人组织激肽释放酶的细胞，其上包覆着具有刚性和双向流通性的包膜材料。所述包膜材料为天然纤维海藻酸钠、多聚赖氨酸、脱乙酰几丁质、琼脂糖、聚丙烯酰胺、羧甲基纤维素钠，人造纤维，合成高聚物及其复合材料，动物皮肤或组织包膜；所述细胞通常选用小鼠成纤维细胞、成肌细胞或肾细胞；人组织激肽释放酶的微囊化细胞的微囊化方法，其过程如下1)构建组织激肽释放酶腺病毒表达载体；2)重组腺病毒Ad.CMV-cHK转染细胞；3)细胞的微囊化操作。微囊化方法中所述2)重组腺病毒Ad.CMV-cHK转染细胞具体为将0.1～1×107pfu的病毒加入到1～2×106个/mL细胞培养液中，混匀，病毒即吸附到细胞表面，进入细胞内；所述3)细胞的微囊化操作具体为挑选生长良好并高表达人组织激肽释放酶的小鼠成纤维细胞进行微囊化处理，取0.5～2×107细胞与1毫升12～16g/L海藻酸钠，充分混匀，以压缩氮气将此混合物通过针头喷洒入100mM氯化钙溶液中，形成珠状的海藻酸钠钙凝胶颗粒，收集颗粒，用分子量24kDa Sigma 0.4～0.6g/L多聚赖氨酸处理5～8分钟，再用1.3～1.5g/L海藻酸钠处理2～4分钟，生理盐水洗涤，最后用pH7.410mM柠檬酸钠液化微胶囊核心海藻酸钙，培养于DMEM+10％胎牛血清培养液中培养。本发明将人组织激肽释放酶的微囊化细胞应用于治疗高血压和/或肾脏疾病中。所述肾脏疾病为肾损伤、肾毒性、高血压相关性肾疾病、盐诱导的肾损伤、肾小球硬化灶、肾小管损伤、药物诱发的肾损伤、慢性肾衰竭、急性肾衰竭，肾病综合征或糖尿病性肾病。
本发明具有如下优点1.适于临床需要。本发明将基因工程方法构建的人组织激肽释放酶腺病毒表达载体转染到细胞内(文献6Chao J，Jin L，Chen L.M.，Chen V.C.，Chao L.Systemic and portal vein delivery of human tissue kallikrein gene reduces bloodpressure in hypertensive rats，Hum Gene Ther.，1996；7901-911)，将表达组织激肽释放酶的细胞置于特殊设计的微囊中，将微囊化细胞移植到机体组织或器官。微囊的特殊结构可以避免可能对人体有害的病毒成分与组织或器官直接接触，可以克服机体对异体组织细胞的免疫排斥作用。微囊的双向流通性可以将体液中的营养物质输送给微囊内细胞并将微囊内细胞分泌的组织激肽释放酶输送到靶组织或器官，从而起到治疗作用(文献7Tai T，Sun A.M.Microencapsulation of recombinant cellsa new delivery system for gene therapy，FASEBJ.，1993；7(11)1061-1067)。
2.适于实际应用。
1)本发明将含有人组织激肽释放酶cDNA的腺病毒载体转染小鼠成纤维细胞，使小鼠成纤维细胞稳定表达人组织激肽释放酶；2)本发明将表达人组织激肽释放酶的小鼠成纤维细胞进行微囊化处理，微囊对囊内细胞具有免疫隔离作用；
3)微囊包膜选用海藻酸钠，多聚赖氨酸，也可以选用天然纤维，人造纤维，合成高聚物及其复合材料，动物皮肤，组织包膜或类似物，提高了微囊膜的生物相容性和物理稳定性。
3.应用效果明显。将微囊化人组织激肽释放酶基因修饰小鼠成纤维细胞移植到高盐饮食Dahl-SS大鼠腹腔，微囊内细胞分泌组织激肽释放酶对高盐饮食Dahl-SS大鼠的血压升高，肾小球，肾小管损伤，肾功能障碍具有明显的改善作用。
4.方法确实可行。
1)微囊化人组织激肽释放酶基因修饰小鼠成纤维细胞体外培养，囊内细胞呈线性生长，体外培养第1天每个微囊内细胞数为33±4，在培养第16天细胞数为620±32。16天后达到平台期，至培养3个月时细胞数保持在550±37左右。台盼蓝染色显示囊内细胞存活率在85％以上。囊内细胞分泌人组织激肽释放酶水平持续增加，第36天达到稳定5.5±0.2pg/细胞。
2)体内移植30天后于不同时间间隔测定人组织激肽释放酶含量显示微囊组大鼠血清中组织激肽释放酶含量(＞15μg/L)明显高于空囊组大鼠(＜6μg/L)。Dahl-SS大鼠移植微囊化人组织激肽释放酶基因修饰小鼠成纤维细胞后血压降低，肾小球肾小管损伤减轻，肾功能改善。

实施例11)建组织激肽释放酶腺病毒表达载体组织激肽释放酶腺病毒表达载体的构建如文献所述(文献6Chao J，Jin L，Chen LM，Chen VC，Chao L.Systemic and portal vein delivery of human tissuekallikrein gene reduces blood pressure in hypertensive rats，Hum Gene Ther.，1996；7901-911)。组织激肽释放酶cDNA片段位于巨细胞病毒(CMV)增强子/启动子调控下，cDNA末端添加牛生长激素基因加polyA信号序列，将转录单位CMV-cHK-pA插入腺病毒穿梭载体pAdLink.1的EcoR V位点处，构建重组质粒pAd.CMV-cHK。纯化的质粒pAd.CMV-cHK送到人类基因治疗研究所产生含有转录单位CMV-cHK-pA的腺病毒Ad.CMV-cHK。
2)组腺病毒Ad.CMV-cHK转染细胞将重组腺病毒Ad.CMV-cHK转染小鼠成纤维细胞。成纤维细胞容易繁殖，易于利用各种基因转移技术进行修饰，而且成纤维细胞活跃参与固有分泌活动。将培养的小鼠成纤维细胞计数后，按1～2×106/mL转入培养瓶继续培养2～3小时后进行腺病毒Ad.CMV-cHK转染，病毒用量为0.1×细胞密度×培养体积/病毒滴度。如将0.1ml 1×107pfu的病毒加入到5ml密度为1×106/mL细胞培养液中，混匀，病毒即吸附到细胞表面，进入细胞内；接受腺病毒Ad.CMV-cHK转染的细胞也可以选用小鼠成肌细胞，肾细胞等。
3)细胞的微囊化操作挑选生长良好并高表达人组织激肽释放酶的小鼠成纤维细胞进行微囊化处理。取1×107细胞与1毫升14g/L海藻酸钠(Kelco-Gel LV，Clark，N.Y)充分混匀，以压缩氮气将此混合物通过针头喷洒入100mM CaCl2溶液中，形成珠状的海藻酸钠钙凝胶颗粒，收集颗粒，用0.5g/L多聚赖氨酸(分子量24kDaSigma)处理5-8分钟，再用1.4g/L海藻酸钠处理2-4分钟，生理盐水洗涤两次，最后用10mM柠檬酸钠(pH7.4)液化微胶囊核心海藻酸钙，培养于DMEM+10％胎牛血清培养液中，2周后用于移植。微囊包膜材料除了海藻酸钠，多聚赖氨酸外也可以采用脱乙酰几丁质，琼脂糖，聚丙烯酰胺及羧甲基纤维素钠等天然纤维，人造纤维，合成高聚物及其复合材料，动物皮肤，组织包膜或类似物。包膜需具有一定的刚性和强度和双向流通的性质。
4)微囊化细胞体外培养将微囊于DMEM+10％胎牛血清培养液中培养一定时间后，机械破碎微囊，分离囊内细胞并用4g/L台盼蓝染色5分钟，离心弃去上清，用生理盐水洗涤两次，在显微镜下观察。囊内细胞呈线性生长，体外培养第1天每个微囊内细胞数为33±4，在培养第16天细胞数为620±32.16天后达到平台期，至培养3个月时细胞数保持在550±37左右。台盼蓝染色显示囊内细胞存活率在85％以上。
5)酶连免疫吸附试验(ELISA)测定培养上清中人组织激肽释放酶含量利用ELISA测定培养上清中人组织激肽释放酶含量(文献8ShimamotoK.，Tanaka S.，Nakao T.，Ando T.，Nakahashi Y.，Sakuma M，Miyahara MMeasurement of urinary kallikrein activity by kinin radioimmunoassay，Jpn CircJ43147-152，1979)。兔抗人组织激肽释放酶抗体IgG与生物素偶连。以兔抗人组织激肽释放酶IgG(2μg/ml，100μl/well)4℃过夜包被96微孔板，每孔加入100μl纯化的人组织激肽释放酶标准品(0.04～2.5ng)和微囊化细胞培养上清样品，标准品以PBS配制(其中含有0.05％Tween-20和0.5％明胶)。每孔加入100μl浓度为1μg/ml生物素标记的兔抗人组织激肽释放酶抗体IgG，加入100μl浓度为1μg/ml的过氧化物酶-亲和素，37℃反应60分钟。每孔加入100μl新鲜配制的底物
室温反应30分钟，以酶标仪于T 404nm进行读数。结果显示移植30天时经腹腔移植微囊化人组织激肽释放酶基因修饰小鼠成纤维细胞的大鼠血清中人组织激肽释放酶明显高于对照大鼠。
6)模型本研究利用Dahl-SS大鼠(雄性，4周龄)(Sprague-Dawley Harlan，Indianapolis，IN)。将21只Dahl-SS大鼠分成两组第一组(7只)给予正常饮食(0.4％NaCl)，第二组(14只)给予高盐饮食(4％NaCl)，饲养4周制备高血压和肾脏损伤动物模型。
7)微囊移植将14只高盐饮食Dahl-SS大鼠分成两组(1)微囊化人组织激肽释放酶基因修饰小鼠成纤维细胞移植组(微囊组)共7只大鼠，将微囊(约200个)吸入微量进样器，缓慢注入大鼠腹腔；(2)空微囊移植对照组(空囊组)7只大鼠，每只大鼠由腹腔植入约200个不含成纤维细胞的空微胶囊。微囊移植也可以根据治疗疾病和靶器官的不同采用动脉插管法，管饲法，静脉注射，肌肉注射，经皮注射，局部注射等方式。
8)血压测定利用压力流速计(model KN-210-1；Narco Bio-systems)由大鼠尾部测定收缩压水平。将非麻醉状态大鼠置于33-35℃恒温容器中，在大鼠已适应周围环境后进行血压测定。每只大鼠测量10次取平均值。结果显示腹腔移植微囊化人组织激肽释放酶基因修饰小鼠成纤维细胞组大鼠的血压水平明显低于对照组。
9)肾功能测定肾小球滤过率和肾血流量实验结束后，麻醉动物，将大鼠放置于加热的实验台上以维持体温。气管切开后，进行颈静脉插管，左侧股动脉插管测定血压和收集血样，膀胱插管收集尿液。实验过程中由颈静脉插管以1.2ml/小时流速向大鼠体内灌注生理盐水(含有菊粉和2％对氨基马尿酸)(Merck Sharp & Dohme，West Point，PA，USA)，45分钟达到稳定状态后，进行时控血液，尿液收集。实验结束后切除双肾并称重，测定尿液体积，利用改进的蒽酮和比色方法测定菊粉和对氨基马尿酸浓度(文献9Fulir J.，Kaczmarczk J.，Kruttgen C.D.，Eine einfachecolorimetrische methode zur inulin-bestimmung furnieren-clearance-untersuchungen bei stoffwecksel-gesunden und diabetiken，KlinWochenschr.，1955；33729-730；文献10Smith H.W.，Finkelstein N.，AliminosaL.，Crawford B.，Grabor M.，Renal clearances of substituted hippuric acidderivatives and other aromatic acids in dog and man.J.Clin Invest.，1945；24388-404)。以菊粉清除率测定肾小球滤过率，以对氨基马尿酸清除率测定肾血流量。腹腔移植微囊化人组织激肽释放酶基因修饰小鼠成纤维细胞大鼠与对照大鼠比较肾小球滤过率增加，肾血流量增加，这些结果说明腹腔移植微囊化人组织激肽释放酶基因修饰小鼠成纤维细胞可以改善Dahl-SS大鼠盐诱导的肾功能障碍。
10)组织形态学分析大鼠麻醉后心脏穿刺取血于4℃过夜，1,000xg离心20分钟，血清于-20℃，ELISA方法测定人组织激肽释放酶含量。取肾组织，浸到10％甲醛溶液中，以石蜡包埋，进行5μm厚切片，苏木精-伊红染色和过碘酸-Schiff碱(PAS)染色，进行显微镜和形态定量学分析。所有组织切片都由事先不知情的几个人进行评价。高盐饮食对大鼠肾脏的损伤主要表现为肾小管扩张，特别是近曲小管，扩张的小管腔内聚集着大量的胶体和蛋白管型。腹腔移植微囊化人组织激肽释放酶基因修饰小鼠成纤维细胞的大鼠与对照大鼠相比近曲小管刷状缘损伤和肾小管扩张程度较轻，小管腔内较少发现蛋白管型，肾小球基底膜增厚程度也较轻。结果说明腹腔移植微囊化人组织激肽释放酶基因修饰小鼠成纤维细胞可以改善Dahl-SS大鼠盐诱导的肾损伤。
应用例1
利用Dahl-SS大鼠14只(雄性，4周龄)，给予高盐饮食(含4％NaCl)饲养4周造成大鼠高血压和肾脏损伤模型，取7只大鼠经腹腔移植微囊化人组织激肽释放酶基因修饰小鼠成纤维细胞。移植30天检测到血清中人组织激肽释放酶明显高于对照大鼠16.5±0.1∶5.8±0.2μg/L，n＝7，P＜0.01。测定各组大鼠血压水平(以平均数±标准差表示)，腹腔移植微囊化人组织激肽释放酶基因修饰小鼠成纤维细胞组大鼠的血压水平明显低于对照组(201±3∶221±8mmHg，n＝7，P＜0.01)。制备肾脏组织切片染色后观察肾小球和肾小管病理改变。测定两组大鼠肾小球滤过率和肾血浆流量。腹腔移植微囊化人组织激肽释放酶基因修饰小鼠成纤维细胞的大鼠与对照大鼠相比基底膜增厚程度较轻，近曲小管刷状缘损伤和肾小管扩张程度较轻。高盐饮食对大鼠肾脏的损伤主要表现为肾小管扩张，特别是近曲小管，扩张的小管腔内聚集着大量的胶体和蛋白管型。而腹腔移植微囊化人组织激肽释放酶基因修饰小鼠成纤维细胞大鼠上述病理变化程度明显轻于对照大鼠。腹腔移植微囊化人组织激肽释放酶基因修饰小鼠成纤维细胞大鼠与对照大鼠比较肾小球滤过率增加(0.56±0.06∶0.17±0.05ml/min/g肾重量，n＝7，P＜0.05)，肾血流量增加(6.95±0.31∶1.8±0.07ml/min/g肾重量，n＝7，P＜0.05)这些结果说明腹腔移植微囊化人组织激肽释放酶基因修饰小鼠成纤维细胞可以改善Dahl-SS大鼠盐诱导的肾损伤和肾功能障碍。
应用例2使用Sprague-Dawley大鼠(雄性，体重200～220g，Harlan SpragueDawley，Inc.，Indianapolis，IN)。将大鼠随机分成3组，第一组皮下注射生理盐水作为对照，其他2组按80mg/kg体重由皮下注射硫酸庆大霉素(SigmaChemical，St.Louis，MO)；连续注射10天。硫酸庆大霉素注射的2组大鼠中，一组在注射硫酸庆大霉素第一天时由腹腔腹腔移植微囊化人组织激肽释放酶基因修饰小鼠成纤维细胞，另一组移植空微囊作为对照。微囊移植30天收集血清样品利用改良的尿素酶-靛酚方法测定血尿素氮水平(文献11BauerJ.D.，Carbohydrates and nitrogen compounds，In Bauer JD，ed.ClinicalLaboratory Methods(9th ed)，The C.V.Mosby Company，St.Louis，1982472-505)。注射庆大霉素大鼠与注射生理盐水的对照大鼠相比，体内尿素氮水平升高(40.1±0.3∶24.1±0.1mg/100ml，n＝5，P＜0.01)。注射庆大霉素同时进行人组织激肽释放酶微囊移植大鼠体内尿素氮水平为33.3±0.3mg/100ml，n＝5，比注射庆大霉素进行空微囊移植大鼠体内尿素氮水平显著降低(P＜0.01)。
上述结果表明人组织激肽释放酶微囊移植可以降低庆大霉素诱导肾毒性大鼠体内尿素氮水平。
其中测定肾小球滤过率，肾血流量评价微囊移植对肾功能的影响，庆大霉素肾毒性大鼠给予人组织激肽释放酶微囊移植后与空微囊移植大鼠相比，肾小球滤过率增加1.83±0.05∶0.83±0.04ul/min/g肾重，n＝5，P＜0.01，肾血流量也增加18.9±0.9∶9.2±0.6ul/min/g肾重，n＝5，P＜0.01；制备肾脏组织切片观察微囊移植对肾脏病理改变的影响，通过光镜分析H&E染色的肾脏组织切片形态，庆大霉素肾毒性大鼠出现广泛的皮质肾小管扩张和损伤，大部分近曲小管受到损伤，充满坏死细胞，远曲小管损伤程度较轻，集合管形态相对正常，皮质肾小管腔内常见蛋白管型，髓质肾小管结构尚完整，但腔内可见蛋白管型，特别是外侧髓质区；在人组织激肽释放酶微囊移植大鼠可见近曲小管细胞肿胀，但少见明显的细胞坏死，肾小管扩张较少出现；PAS染色的肾脏组织切片形态分析发现注射庆大霉素大鼠肾皮质小管腔内充满PAS-阳性的管型，大部分的PAS-阳性管型来自于脱落的近曲小管刷状源缘蛋白或近曲小管损伤细胞的重吸收颗粒；人组织激肽释放酶微囊移植大鼠损伤较轻，虽然有些损伤持续存在，但大部分近曲小管结构保持完整，损伤后能够再生，肾皮质髓质小管腔内蛋白管型明显减少。
上述结果说明腹腔移植微囊化人组织激肽释放酶基因修饰小鼠成纤维细胞可以改善庆大霉素引起的大鼠肾脏损伤和肾功能障碍。


本发明涉及人组织激肽释放酶，具体地说是人组织激肽释放酶的微囊化细胞及其微囊化方法和应用；在基因修饰的表达人组织激肽释放酶的细胞上包覆着具有刚性和双向流通性的包膜材料；应用于治疗高血压和/或肾脏疾病中；本发明具有如下优点1.适于临床需要；2.适于实际应用；3.应用效果明显；4.方法确实可行。