专利名称：包含免疫球蛋白Fc片段作为载体的长效抗凝多肽及其制备方法水蛭素(hirudin)是一种单链环肽化合物。肽链由65个氨基酸残基组成，相对分子量为7000道尔顿。分子N端有三个二硫桥键(-S-S-)，分别在6位、14位、16位、28位和 22 位、39 位的半胱氨酸残基(Cys6. . . Cysl4，Cysl6. . . Cys28，Cys22. . . Cys39)，使 N 端肽链绕迭成密集形核心环肽结构。C端富含酸性氨基酸残基，63位的酪氨酸被硫酸化。水蛭素存在十种以上变异体，主要的三种变体简称为HV1、HV2和HV3。其氨基酸序列如下所示。HVl VVYDTCTESGQNLCLCEGSNVCGQGNKCILGSDGEKNQCVTGEGTPKPQSHNDGDFEEIPEEYLQHV2 ITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGKGNKCILGSNGKGNQCVTGEGTPNPESHNNGDFEEIPEEYLQHV3 ITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGKGNKCILGSNGKGNQCVTGEGTPKPQSHNQGDFEEPIPEDAYDE这些变异体肽链中都不含精氨酸、色氨酸和蛋氨酸。它们具有较高的同源性和基本相似的一级结构，其主要差别是N端氨基酸序列不同，但都具有相似的抗凝活性。核磁共振研究表明，水蛭素的变异体中不存在二级结构的α螺旋构型。N端的5个氨基酸残基为疏水基团，C端则为亲水基团，并游离在分子的表面。研究认为水蛭素肽链的二级和三级结构对其抗凝活性起决定性作用，其N端的三个二硫桥键则是决定分子二级和三级结构及其稳定性的关键，将二硫键氧化，或分子发生蛋白降解，则失去抗凝活性。若C端羧基被酯化， 或失去C端氨基酸，也会失去与凝血酶结合的能力。可见水蛭素的C端部分是抗凝活性所必需的，含二硫键N端疏水结构对水蛭素抗凝血酶作用亦有重要影响。水蛭素能够直接与凝血酶发生不可逆的结合，使凝血酶失活，为目前发现的最强有力的凝血酶抑制剂。作为一种抗血栓药物，水蛭素已经被用于血栓相关性疾病的治疗和预防，如肝素引起的血小板减少症II型、深静脉血栓和不稳定型心绞痛等。但是，水蛭素在人体内的半衰期只有1至2小时，临床给药间隔较短，用药量较大。 对水蛭素进行长效化处理，如以聚乙二醇修饰水蛭素，以及将水蛭素与白蛋白融合表达等， 均可增大水蛭素分子尺寸，降低水蛭素在体内的清除率，进而延长其半衰期，减少用药次数，同时又可利用血药浓度维持时间长这一优点降低水蛭素的给药量，减小其抗凝活性强所带来的出血风险。专利US536^58及专利US5663141即是用聚乙二醇修饰的方法来达到这一目的，但水蛭素的血浆半衰期提高有限，并且，采用长链聚乙二醇虽然能够进一步延长血浆半衰期，但同时也会降低其生物活性。文献(Syed S，Schuyler PD, Kulczyckx Μ, et al. Blood, 1997 ；89 =3243-3252)将水蛭素通过肽链C端与血清白蛋白利用大肠杆菌融合表达，从而在不明显降低抗凝活性的基础上延长了半衰期，但这一手段明显加大了生产的难度。申请号为CN200480001775的中国专利申请公开了一种新的药物长效化技术，即将免疫球蛋白Fc片段作为载体并通过如聚乙二醇之类的连接物与目标蛋白相连，不仅大大提高药物的血浆半衰期，而且降低了药物引起免疫应答的几率，同时又可在保留活性的基础之上降低药物长效化处理的难度。聚乙二醇作为蛋白的修饰物，常用的反应功能基团有，可修饰伯胺或仲胺的琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇(PEG Succinimidyl Succinate, PEG-SS)、琥珀酰亚胺丙酸酯聚乙二醇(PEG Succinimidyl Propionate, PEG-SPA)、琥珀酰亚胺聚乙二醇(PEGSuccinimide，PEG-NHS)、醛类聚乙二醇(PEG-Aldehyde，PEG-ALD)等；可修饰羧基的聚乙二醇胺类衍生物(PEG-0-CH2CH2-NH2，PEG-NH2)；以及可修饰巯基的马来酰亚胺聚乙二醇(PEG Maleimide，PEG-MAL)等。CN200480001775列举了多种可与免疫球蛋白Fc片段连接的生理学活性多肽药物，其中包括水蛭素，但是并没有记载将免疫球蛋白Fc片段作为载体并通过聚乙二醇与目标蛋白相连的具体制备工艺。本发明人在研究中发现，当聚乙二醇作为连接物而在其两端分别修饰免疫球蛋白 Fc片段以及水蛭素时，应首先保证Fc部分的均质性，因此，最好选用可在一定条件下稳定且特异性修饰1-氨基的醛类聚乙二醇衍生物。在这种情况下，水蛭素部分也应以醛基连接聚乙二醇，目的是降低连接物以及终产物制备过程的复杂性。但是，对于水蛭素来说，N端氨基酸的修饰可使其丧失活性。
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种包含免疫球蛋白Fc 片段作为载体的长效抗凝多肽，其既保持原抗凝多肽的活性又使其血浆半衰期大大提高。本发明的另一目的在于提供所述长效抗凝多肽的制备方法。本发明的再一目的在于提供包含所述长效抗凝多肽的药物组合物。本发明的还一目的在于提供所述长效抗凝多肽在制备防治血栓性疾病的药物中的应用。根据本发明的目的，本发明提供了一种包含免疫球蛋白Fc片段作为载体的长效抗凝多肽，所述长效抗凝多肽是由抗凝多肽分子通过聚乙二醇(PEG)与免疫球蛋白的Fc片段共价连接而成。根据本发明的另一目的，本发明提供了所述长效抗凝多肽的制备方法，其包括以下步骤al)将免疫球蛋白Fc片段或抗凝多肽与活化的PEG的一端共价连接；a2)从所得反应混合物中分离含有与所述PEG共价连接的免疫球蛋白Fc片段或抗凝多肽的复合物；以及a3)将免疫球蛋白Fc片段或抗凝多肽与所述分离复合物中PEG的另一端共价连接，得到含有与PEG各端连接的免疫球蛋白Fc片段和抗凝多肽的长效抗凝多肽。本发明提供的长效抗凝多肽，在保持抗凝多肽的原有抗凝活性基本不变的基础上大大提高了药物的血浆半衰期，延长了临床给药间隔时间，改善了抗凝药品的使用性。现通过以下实施方式并且结合附图来进一步描述本发明的有益效果，应理解为这些实施方式仅用于例证的目的，不限制本发明的范围，同时本领域普通技术人员根据本发明所做的显而易见的改变和修饰也包含在本发明范围之内。图1为本发明中N-PEG化反应后收集N-PEG-Hirudin洗脱馏分的洗脱曲线图谱。图2A和图2B分别为经纯化N-PEG化水蛭素分子量的电喷雾质谱检测结果以及尺寸排阻高效液相色谱纯度检测结果。图3为本发明中K-PEG化反应后收集K-PEG化水蛭素洗脱馏分的洗脱曲线图谱。图4A和图4B分别为经纯化K-PEG化水蛭素分子量的电喷雾质谱检测结果以及尺寸排阻高效液相色谱纯度检测结果。图5为本发明中PEG化位点的检测图谱。图6A和图6B分别为长效水蛭素即HV2 (Lys47) _3. 4kPEG_Fc的聚丙烯酰胺凝胶电泳及尺寸排阻高效液相色谱的检测结果。
中，抗凝多肽部分为基因重组水蛭素变体2 (HV2-Lys47)。HV2_Lys47部分优选通过赖氨酸残基与聚乙二醇共价连接。在本发明中，所述聚乙二醇分子是线性的，并且两端均有功能基团。所述功能基团可为醛基(ALD)、琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺碳酸酯(SC)或者是琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA)。聚乙二醇分子两端的功能基团可以是一种，也可以是上述的基团中不同的两种，优选均为醛基。聚乙二醇的分子量在500至60000道尔顿之间，优选在2000至5000道尔顿之间。在本发明中，所述的免疫球蛋白Fc片段是非糖基化的。所述的免疫球蛋白Fc片段由选自CH1、CH2、CH3、CH4结构域中的1个到4个结构域组成。所述免疫球蛋白Fc片段还包含铰链区。优选地，所述的免疫球蛋白Fc片段选自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM的Fc片段以及它们的组合和杂合体组成的组。更优选地，所述的免疫球蛋白Fc片段选自IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4的Fc片段以及它们的组合和杂合体组成的组。还优选地，所述的免疫球蛋白Fc 片段是IgG4的Fc片段。在一个较佳实施方式中，所述的免疫球蛋白Fc片段为人非糖基化 IgG4Fc 片段。在本发明的一个优选实施方式中，所述抗凝多肽为水蛭素。本发明通过将同种双功能基团聚乙二醇(ALD-PEG-ALD) —比一地修饰在水蛭素的特定赖氨酸残基上，制备出高均质性的PEG化水蛭素，进而与免疫球蛋白Fc片段相连接，可得到既保持原水蛭素活性又使血浆半衰期大大提高的产物，即Hirudin-PEG-Fc。
在本发明中，药物活性部分并不局限于基因重组来源的水蛭素，天然水蛭素或具有抗凝血作用的多肽都可以是本发明的应用对象，优选重组水蛭素。根据本发明的另一方面，本发明提供了所述长效抗凝多肽的制备方法，其包括以下步骤al)将免疫球蛋白Fc片段或抗凝多肽与活化的PEG的一端共价连接；a2)从所得反应混合物中分离含有与所述PEG共价连接的免疫球蛋白Fc片段或抗凝多肽的复合物；以及a3)将免疫球蛋白Fc片段或抗凝多肽与所述分离复合物中PEG的另一端共价连接，得到含有与PEG各端连接的免疫球蛋白Fc片段和抗凝多肽的长效抗凝多肽。所述制备方法可进一步包括以下步骤b)从反应液中分离纯化所述长效抗凝多肽。其中，在步骤al)中，抗凝多肽和PEG以反应摩尔比例1 1. 25至1 25使用； 或免疫球蛋白Fc片段和PEG以反应摩尔比例1 5至1 10使用；且其中，在步骤a3)中，获自步骤a2)的复合物与免疫球蛋白Fc片段或所述抗凝多肽以反应摩尔比例1 0. 5至1 20使用；其中所述PEG通过其自身两端的反应性基团与抗凝多肽和免疫球蛋白Fc片段共价连接，其中所述PEG的反应性基团选自醛基、琥珀酰亚胺基丙酸酯、和羟基琥珀酰亚胺， 以及其中所述长效抗凝多肽中的抗凝多肽、PEG、免疫球蛋白Fc片段的摩尔比为 1:1:1。在上述方法中，所述醛基优选为丙醛基或丁醛基。在上述方法中，步骤(al)和(U)优选在还原剂的存在下进行，其中所述还原剂可选自氰基硼氢化钠、硼氢化钠、硼酸二甲胺和硼酸吡啶。当所述抗凝多肽为水蛭素时，所述制备方法可包括以下步骤1)水蛭素的PEG化，即水蛭素与ALD-PEG-ALD进行亲核反应；以及2) PEG化水蛭素与Fc进一步连接。其中，同种双功能基团聚乙二醇(ALD-PEG-ALD)与水蛭素反应方法的条件为1)将所述ALD-PEG-ALD与水蛭素在碱性缓冲液中混合，在氰基硼氢化钠(SCB)的存在下进行反应，反应的PH为7 11，优选9.5 ；2)混合的比例为5 1 25 1，优选20 1 ；3)反应温度为1 °C 40°C，优选4°C ；4)水蛭素浓度为 0. lmg/mL 100mg/mL，优选 5mg/mL ；5)反应时间为1小时 M小时，优选1小时。另外，水蛭素的PEG化还涉及到将特异性位点单修饰水蛭素从上述反应液中分离出来的一步纯化方法。在该纯化方法中，纯化所用吸附剂为阳离子交换吸附剂，所述阳离子交换吸附剂可以为强阳离子交换吸附剂，如磺丙基型(SP)吸附剂，也可以为弱阳离子交换吸附剂，如羧甲基型(CM)吸附剂，优选强阳离子型离子交换吸附剂。
根据本发明的再一方面，本发明提供了包含所述长效抗凝多肽的药物组合物，其包含本发明的长效抗凝多肽以及适量的药剂学上可接受的辅料。本发明的药物组合物可通过任何可行的常规途径施用，例如注射、口服等，优选注射途径。由于在口服给药时某些抗凝多肽会被消化，因此口服给药组合物的活性成分应被特殊配制或者包裹以保护其在胃中免于降解。对口服给药而言，药剂学上可接受的辅料可包括赋形剂、崩解剂、分散剂、粘合剂等。对注射给药而言，药剂学上可接受的辅料可包括缓冲剂、稳定剂、增溶剂等。本发明的药物组合物可与药剂学上可接受的辅料组合制备成各种剂型，例如片剂、胶囊剂、注射液等。根据本发明的还一方面，本发明提供了所述长效抗凝多肽在制备防治血栓性疾病的药物中的应用。所述血栓性疾病是由以下两种病理过程所引起的疾病1)血栓形成是指在一定条件下，血液有形成分在血管(多数为小血管)形成栓子，造成血管部分或完全堵塞、相应部位血供障碍的病理过程。依血栓组成成分可分为血小板血栓、红细胞血栓、纤维蛋白血栓、混合血栓等4种。按血管种类可分为动脉性、静脉性及毛细血管性血栓。2)血栓栓塞是血栓由形成部位脱落，在随血流移动的过程中部分或全部堵塞某些血管，引起相应组织和(或)器官缺血、缺氧、坏死(动脉血栓)及瘀血、水肿(静脉血栓)的病理过程。本发明采用了独特的反应条件及纯化手段，将同种双功能基团聚乙二醇 (ALD-PEG-ALD) 一比一地修饰在水蛭素的特定赖氨酸残基上，从而可制备出高均质性的 PEG化水蛭素，进而，通过将其与免疫球蛋白Fc片段连接，可得到既保持原水蛭素活性又使血浆半衰期大大提高的产物，即Hirudin-PEG-Fc。从以下实施例中可更好地理解本发明，然而这些实施例仅为举例说明，而不应被认为是对本发明的限制。如无特别说明，在以下实施例中所用原料均为市售产品。实施例1 双功能基团聚乙二醇(propionaldehyde-3. 4KPEG-propionaldehyde, ALD-PEG-ALD)单修饰水蛭素HV2 (Lys47)的制备1) PEG化反应及产物分离①N端修饰PEG化(N-PEG化)水蛭素的制备反应所用的水蛭素为第47位天冬酰胺突变成赖氨酸的变体2 (HV2 (Lys47))，氨基酸序列为 ITYTDCTESG QNLCLCEGSN VCGKGNKCILGSNGKGNQCV TGEGTPKPES WGDFEEIPEE YLT, 由重组毕赤酵母表达而来，通过反相高效液相色谱分析其纯度，结果大于95%。反应体系为16mg水蛭素，浓度为5mg/mL ；溶剂为20mM磷酸盐缓冲液(pH6. 0)；以水蛭素聚乙二醇 =1 10的摩尔比添加聚乙二醇；并添加氰基硼氢化钠(SCB)至其终浓度为20mM ；4°C下反应1小时。采用AKTAexplorer 100型蛋白纯化系统(GE Healthcare)以及强阴离子交换色谱柱Source Q(16mm I. D.，105mL，GE Healthcare)进行纯化。首先以流动相A即20mM Tris-盐酸缓冲液(pH 7. 5)平衡色谱柱，并通过超滤将上述步骤所得反应混合物的缓冲液更换为同流动相A相同的缓冲液，之后进行上样，流速为3ml/min，并进行冲洗，然后以梯度方式进行洗脱，流动相B为在流动相A中添加IM氯化钠而成，洗脱条件为先以10% B等度洗脱3倍柱体积，后在6倍柱体积内由10%B升至20%B。洗脱图谱如图1所示。收集所标示的洗脱峰，分别用尺寸排阻高效液相色谱(所用仪器型号为Agilent 1200型高效液相色谱仪)及电喷雾-离子阱质谱(HCT Series, Bruker Daltonics)进行纯度测定及鉴定， 结果分别如图2A和2B所示。由图2A所示质谱结果推算的分子量可以判定图1所标示洗脱峰所收集的反应产物应为双功能团聚乙二醇单修饰水蛭素HV2，从图2B所示尺寸排阻高效液相色谱结果可以判定图1所标示的洗脱峰中收集的反应产物纯度为97%，进一步根据本反应的具体反应条件可知所得产物应为N端修饰PEG化(N-PEG化)水蛭素。②赖氨酸修饰PEG化(K-PEG化)水蛭素的制备反应所用的水蛭素为第47位天冬酰胺突变成赖氨酸的变体2 (HV2 (Lys47))，氨基酸序列为 ITYTDCTESG QNLCLCEGSN VCGKGNKCILGSNGKGNQCV TGEGTPKPES WGDFEEIPEE YLT, 由重组毕赤酵母表达而来，通过反相高效液相色谱分析其纯度，结果大于95%。反应体系为30mg水蛭素，浓度为5mg/mL ；溶剂为IOOmM硼酸(pH 9. 5)水溶液；以水蛭素聚乙二醇=1 15的摩尔比添加聚乙二醇；并添加氰基硼氢化钠(SCB)至其浓度为20mM;4°C下反应1小时。采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(GE Healthcare)以及强阳离子交换色谱柱Source S (16mm I. D.，105mL，GE Healthcare)进行纯化。首先以流动相A即2OmM醋酸-醋酸钠缓冲液(PH 3. 5)平衡色谱柱，并通过超滤将上述步骤所得反应混合物的缓冲液更换为同流动相A相同的缓冲液，之后进行上样，流速为3ml/min，并进行冲洗，然后以梯度方式进行洗脱，流动相B为在流动相A中添加IM氯化钠而成，洗脱条件为流速3ml/min， 在20分钟内由0% B升至20% B。洗脱曲线如图3所示。收集所标示的洗脱峰，并分别用尺寸排阻高效液相色谱(所用仪器型号为Agilent 1200型高效液相色谱仪，TOSOH TSKgel G2000SWxl色谱柱)及电喷雾-离子阱质谱(HCT Series, BrukerDaltonics)对其进行纯度测定及鉴定，结果分别如图4A和图4B所示。由图4A所示质谱结果推算的分子量可以判定图3所标示洗脱峰所收集的反应产物应为双功能团聚乙二醇单修饰水蛭素HV2，从图 4B所示尺寸排阻高效液相色谱结果可以判定图3所标示的洗脱峰中收集的反应产物纯度为91. 9 %，进一步根据本反应的具体反应条件可知所得产物应为赖氨酸修饰PEG化(K-PEG 化)水蛭素。2) PEG化位点的检测首先，对上述步骤所得的2种PEG化水蛭素产品进行酶切。水解酶为 Trypsin (Promega)，酶切反应条件50 μ g 样品溶于 50mM Tris-HCl (pH 8. 0)，8M 尿素，50mM DTT，65°C，30min，加入终浓度为IOOmM的碘乙酸钠，室温，避光，40min，更换缓冲液为50mM Tris-HCKpH 8. 0), ImM CaCl2，样品Trypsin = 50 1 (W/W)，37°C 下水解 16 小时。然后，对酶水解产物进行反相高效液相色谱分析。采用安捷伦1200高效液相色谱系统以及 YMC-PackODS-A (5 μ m, 25cm χ 0. 46cm i. d.)色谱柱，流动相 A 为 0. 1 % TFA/ 水，流动相 B 为 0. 1 % TFA/90 %乙腈，流速为lml/min，进样体积50 μ L，梯度洗脱(0 70min内，5 % B 60% B)，在214nm进行检测。结果由图5所示，图5中各色谱峰所代表的肽段由电喷雾-离子阱质谱仪(HCT Series, Bruker Daltonics)所鉴定。根据图5所得数据在下表中列出表

本发明提供了一种包含免疫球蛋白Fc片段作为载体的长效抗凝多肽及其制备方法，其中，所述长效抗凝多肽是由抗凝多肽分子通过聚乙二醇与免疫球蛋白的Fc片段共价连接而成。本发明还提供了所述长效抗凝多肽在制备预防和/或治疗血栓性疾病的药物中的应用，以及包含所述长效抗凝多肽的药物组合物。本发明提供的长效抗凝多肽，在保持抗凝多肽的原有抗凝活性基本不变的基础上大大提高了药物的血浆半衰期，延长了临床给药间隔时间，改善了抗凝药品的使用性。