瓯柑油胞层粗提物在抑制卵巢癌转移中的应用的制作方法[0002]随着人类生存环境、生活压力、人口老龄化等自然和社会环境诸多因素的变化，恶性肿瘤发病率和死亡率不断攀升，严重威胁人类的健康和生命。而肿瘤转移是造成患者死亡的重要原因，90%的肿瘤病人在五年内死于复发和转移。卵巢癌是女性生殖系统的三大恶性肿瘤之一,其发病率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌,但死亡率却高居妇科恶性肿瘤之首。由于病因不明，缺乏早期临床症状，卵巢癌的诊断与治疗一直是医学上的一大难题，据相关统计资料显示，70%的卵巢癌患者在初次就诊时就已出现腹水甚至远端转移，5年生存率仅为25% — 30%，因此，临床上亟需防治卵巢癌转移的药物治疗手段。EMT作为一种基本的生理病理现象，参与了胚胎早期发育、组织重建等多种生理过程，近年来研究表明，EMT的异常发生和肿瘤的发展转移具有密切的联系。发生EMT的上皮肿瘤细胞表型发生改变，负责细胞-细胞间黏附的上皮标记物E-钙黏蛋白(E-cadherin)丢失，角蛋白为主的细胞骨架转变为间质细胞标记物Fibronectin、Vimentin为主的细胞骨架；这种表型转变的结果是肿瘤细胞摆脱细胞-细胞间连接，细胞失去极性，黏附力下降，运动能力增强，沿细胞外基质发生远距离迁移，最终完成肿瘤的侵袭和转移。在此过程中，E-cadherin的缺失是EMT的典型特征，其表达水平通常与肿瘤的分期即恶性程度呈负相关。由此可见，EMT是肿瘤细胞脱离原发灶的初始步骤，针对EMT过程的关键分子，发展阻碍EMT发生的治疗策略，将成为控制肿瘤转移的有效手段。目前对于癌症的治疗多采用手术治疗，放射治疗及化学治疗等，这些治疗手段具有一定的毒副作用。流行病学研究表明，多食水果蔬菜的人群具有较低的恶性肿瘤等慢性疾病发病率，因此从天然产物中开发具有低毒高药学活性功能的制剂及开发功能食品或保健品具有深远的意义。[0003]瓯柑加工副产物油胞层粗提物，关于其药学活性的报道相对较少，多集中在降压、降血糖、抗氧化、增强免疫机能的活性研究，但其抑制肿瘤转移的作用却未见报道。
[0004]本发明的目的是提供一种瓯柑油胞层粗提物在制备防治卵巢癌转移的药物中的应用，研究证实柑橘类水果瓯柑的油胞层中可提取到具有抑制肿瘤转移作用的天然产物，研究证实瓯柑油胞层粗提物表现出抑制人卵巢癌细胞系SK0V3细胞转移的活性，瓯柑油胞层粗提物具有明确的抑制肿瘤转移的作用。[0005]本发明的另一个目的是提供一种瓯柑油胞层粗提物在制备防治卵巢癌转移的复方药物中的应用，所述复方药物可由任何重量比的瓯柑油胞层粗提物与其它抗肿瘤药物制成。[0006]研究证实柑橘类水果瓯柑的油胞层中可提取到具有抑制肿瘤细胞SK0V3转移作用的产物，其中的成分包括柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、橘皮素、5-去甲川陈皮素。瓯柑油胞层粗提物具有明确的对抗肿瘤转移的活性，从而有望与其它抗肿瘤药物(如紫杉醇、环磷酰胺、卡钼等)合用，可减少临床现有抗肿瘤药物的用量，协同抗肿瘤并减少现有药物的不良反应。[0007]本发明的再一个目的是提供一种瓯柑油胞层粗提物在制备防治肿瘤转移的保健品中的应用。所述保健品由柑橘类水果瓯柑油胞层粗提物与允许的食品添加剂制成，或者由任何重量比的瓯柑油胞层粗提物与其它有效成分(可以是单体，也可以是混合物)及允许的食品添加剂制成。采用含有瓯柑油胞层活性成分的柑橘类水果果皮或中药，经初步提取后与其他具有抗肿瘤活性的天然物质制成保健品，用于防治肿瘤转移的发生。[0008]本发明强调瓯柑油胞层粗提物作为一种抗转移相关的肿瘤的辅助治疗药物或保健品的新用途。
[0009]本发明所述瓯柑油胞层粗提物通过以下步骤获得:
(1)称取瓯柑油胞层冷冻干燥粉末，用80%丙酮(固液比1:20)超声，提取液离心，重复两次，合并上清液，在旋转蒸发仪上蒸干后溶于去离子水中；
(2)水提液用固相萃取SPEC18柱进行纯化(Waters，12 cc,2 g)，SPE小柱首先用甲醇活化，再用去离子水平衡，然后提取液以I mL/min的流速上样，待充分吸附后，小柱用40 mL去离子水淋洗以洗去果实中的糖酸等极性物质，真空抽干后用80 mL甲醇充分洗脱，洗脱液用真空干燥成粉末，得瓯柑油胞层粗提物。
[0010]本发明通过从柑橘类瓯柑中提取得到油胞层粗提物，并进行抑制肿瘤转移生物活性的研究，以达到将其应用于相关疾病防治的目的。瓯柑油胞层粗提物能够明显降低人卵巢癌细胞SK0V3的运动能力，并能抑制TGF-β所诱导的上皮间质转化的发生，提示其潜在的抑制肿瘤转移的活性。瓯柑油胞层粗提物与其它有效成分(可以是单体，也可以是混合物)及允许的食品添加剂制成的保健品，可用于防治肿瘤转移的发生。



[0011]图1是瓯柑油胞层SPE粉末的提取流程。
[0012]图2是瓯柑油胞层SPE粉末的HPLC图谱:1_7号峰分别为柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、橘皮素、5-去甲川陈皮素。
[0013]图3是瓯柑油胞层粗提物对卵巢癌SK0V3肿瘤细胞的增殖抑制结果。
[0014]图4Α是瓯柑油胞层粗提物对卵巢癌SK0V3肿瘤细胞的划痕实验结果。
[0015]图4Β是瓯柑油胞层粗提物对卵巢癌SK0V3肿瘤细胞的划痕距离的统计；?检验，与对照组比较，*/"〈0.05，**/"<0.01, ***/"<0.0Ol0
[0016] 图5Α是瓯柑油胞层粗提物对人卵巢癌细胞系SK0V3肿瘤细胞上皮标记物E-钙黏蛋白表达量影响的Western Blot结果。
[0017]图5B是瓯柑油胞层粗提物对人卵巢癌细胞系SK0V3肿瘤细胞上皮标记物E-钙黏蛋白表达量影响进行的光密度分析结果。?检验，与模型对照组比较，**7X0.01。
[0018]图6Α是瓯柑油胞层粗提物对人卵巢癌细胞系SK0V3肿瘤细胞间质标记物纤连蛋白Vimentin表达量影响的Western Blot结果。[0019]图6B是瓯柑油胞层粗提物对人卵巢癌细胞系SK0V3肿瘤细胞间质标记物纤连蛋白Vimentin表达量影响进行的光密度分析结果。t检验,与模型对照组比较，*/^<0.05。

[0020]本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
[0021]实施例1:
本发明中瓯柑油胞层粗提物来源系从柑橘类植物瓯柑的油胞层获得，其制备方法按照如下两个步骤来进行: (I)称取瓯柑油胞层冷冻干燥粉末I g，用80%丙酮20 mL (固液比1:20)超声30 min,频率为60 kHz，功率为30 W。提取液在离心机上4000 rpm离心10 min，如此重复两次，合并上清液，在旋转蒸发仪上蒸干后溶于10 mL去离子水中。瓯柑油胞层粗提物的提取流程见图1。
[0022](2)水提液用固相萃取SPE C18柱进行纯化(Waters，12 cc，2 g)，纯化过程分为活化、平衡、上样、淋洗和洗脱五个步骤:SPE小柱首先用20 mL甲醇活化，再用20 mL去离子水平衡，然后提取液以I mL/min的流速上样，待充分吸附后，小柱用40 mL去离子水淋洗以洗去果实中的糖酸等极性物质，真空抽干后用80 mL甲醇充分洗脱，洗脱液用真空干燥成粉末，得瓯柑油胞层粗提物，称重为61.5 mg备用。瓯柑油胞层粗提物的HPLC图谱见图2。结果显示该粗提物中含有柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、橘皮素、5-去甲川陈皮素。
[0023]实施例2:
对实施例1中提取的天然来源瓯柑油胞层粗提物进行人卵巢癌细胞增殖抑制检测，发现瓯柑油胞层粗提物在一定浓度范围内并不影响细胞的增殖能力。实验方法和结果如下:瓯柑油胞层粗提物作用于人卵巢癌细胞(SK0V3细胞)24 h后抑制细胞的增殖情况。SK0V3 细胞培养于 90% RPM1-1640 (购于 Gibco, Grand Island, NY, US)和 10% 胎牛血清(Gibco，Carlsbad, CA, US)中。具体步骤如下:将对数生长期的细胞消化后，吹打成单细胞悬液，接种于96孔培养板；5 X IO3细胞/孔，每孔培养基200微升，37°C、5% C02培养箱中培养过夜；加入不同浓度瓯柑油胞层粗提物在培养箱中再培养24 h。10%三氯醋酸固定I小时，用双蒸水洗涤，干燥后，每孔加入70微升SRB溶液(4 mg/mL)，室温染色20分钟，1%醋酸洗涤，干燥。每孔加入100微升10 mM Tris-Base溶液使SRB溶解。在平板震荡仪上震荡15 min后，用酶标仪检测各孔OD值(检测波长:515 nm);记录结果；按下列公式计算抑制率:存活率(％) = OD给药/ OD对照X 100%，具体浓度的提取物对SK0V3细胞的抑制效果见图3。每个组别设3个以上复孔。相同实验重复3次以上。
[0024]结果表明，瓯柑油胞层粗提物4 μ g/mL, 20 μ g/mL时，作用人卵巢癌细胞(SK0V3细胞)24 h内，并没有明显的增殖抑制，而在100 μ g/mL时则有明显的增殖抑制。为了排除增殖抑制作用对肿瘤细胞运动能力的干扰，在以下转移相关实验中设置的欧柑油胞层粗提物的浓度为4 μ g/mL和20 μ g/mL。如图3所示。
[0025]实施例3:
对实施例1中提取的天然来源瓯柑油胞层粗提物进行人卵巢癌抗转移活性研究，发现瓯柑油胞层粗提物可抑制肿瘤细胞的划痕修复能力，其划痕距离比对照组明显增加。实验方法和结果如下: 将 人卵巢癌细胞SK0V3种植在24孔板中，用完全培养基培养至细胞基本铺满，形成细胞单层后，饥饿过夜。用100 UL的枪头在单层细胞表面上进行划痕损伤。然后用培液洗一遍划痕，用完全的培养基培养细胞，设置以下组别:不加血清对照组，不加血清4 μ g/mL组，不加血清20 μ g/mL组，加入血清对照组，加入血清4 μ g/mL组，加入血清20 μ g/mL组。之后，继续于37°C、5% C02培养箱培养至24 h后在倒置显微镜(Leica DMI 400B)下观察刮痕愈合程度并拍照。具体浓度的提取物对SKOV3细胞运动能力的抑制效果见图4A和B。每个组别设4个复孔。相同实验重复3次以上。
[0026]结果表明，瓯柑油胞层粗提物4 μ g/mL, 20 μ g/mL作用于SK0V3细胞24 h，血清对照组划痕完全愈合，而4 μ g/mL组和20 μ g/mL组尚未愈合，提示瓯柑油胞层粗提物在不影响细胞增殖的情况下，可以显著抑制人卵巢癌细胞(SK0V3细胞)的运动能力，并具有一定的量效关系。所拍照片如图4A所示，划痕距离统计结果如图4B所示。?检验，与溶剂对照组比较，#*7X0.001。
[0027]实施例4:
本发明发现瓯柑油胞层粗提物作用于人卵巢癌细胞后对相关信号蛋白水平具有明显的影响。实验方法和结果如下:
将人卵巢癌细胞SK0V3种植在6孔板中，10 X IO4细胞/孔，每孔完全培养基2毫升，37°C>5% C02培养箱中培养过夜；饥饿12 h。然后设置以下组别:空白对照组；阴性对照组(加TGF-β I)；瓯柑4 μ g/mL对照组；瓯柑4 μ g/mL作用组(加TGF-β I)；瓯柑20 μ g/mL对照组；瓶柑20 1^/1^作用组(加16?邻1)。给药时，先给予瓯柑油胞层粗提物孵育I h后，再加入 5 ng/mL TGF- β I (R&D systems, Minneapolis, MN, US)。继续于 37°C孵箱中培养至48 h，将细胞收集裂解为相应蛋白样品。裂解后的蛋白样品置于沸水中煮20 min后，储存于 _20°C备用。细胞裂解液为 5XLoading Buffer (0.6mL lmol/L Tris-HCl，5mL50%甘油，2mL 10%SDS,0.5mL 2-巯基乙醇，ImL 1%溴酚蓝，其余用双蒸水补至10mL)。
[0028]蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电泳条件为70V恒压30 min之后，再调整为IlOV恒压电泳至溴酚蓝前沿刚好跑出凝胶即停止电泳。将凝胶上的蛋白转印到PVDF膜(Millipore, Bedford, MA)上，转膜条件为330 mA，恒流，80 min。将膜剪下，并在5%脱脂奶粉(TBS-T配制)中封闭I h，孵育一抗过夜之后，用TBS-T依次洗膜15 min, 5 min,5 min,再孵育二抗 I h 后用 TBS-T 依次洗膜 15 min, 5 min, 5 min。最后用 ECL (AmershamBiosciences, Castle Hill, Australia)检测试剂孵膜I min左右,使蛋白能够在X-射线胶片上显色。具体浓度的提取物对SK0V3细胞EMT上皮及间质蛋白标记物的影响见图5 A和图6A。对于显色的条带再进行光密度分析，并统计为直方图，见图5 B和图6 B。用到的主要抗体如下:E_cadherin, Vimentin 抗体购于 BD ; β-actin 抗体购于 Santa Cruz ;HRP标记的二抗购于联科生物。
[0029]结果表明，对于加入TGF-β I处理的阴性对照组,上皮蛋白E-cadherin明显下调，同时间质蛋白Vimentin明显上调，这说明用TGF-β I处理成功诱导EMT的发生。在药物处理组中，瓯柑油胞层粗提物4 μ g/mL, 20 48/1^作用于人卵巢癌31(0￥3细胞48 h，上皮蛋白E-cadherin明显上升，同时间质蛋白Vimentin明显下调,提示瓶柑油胞层粗提物具有阻断EMT的作用，而该作用可能参与了其抑制肿瘤细胞转移和运动能力的过程。