专利名称：重组人血小板源生长因子的发酵方法 糖尿病是全球性高发疾病之一。1998年的统计数字显示，全球糖尿病患者约有1.43亿人。美国目前大约有1600万人患有糖尿病，中国糖尿病人更是高达4000多万，并且还以每年1‰的速度递增。据WHO专家估计，到2025年全球糖尿病患者将达3亿，其中75％的糖尿病人在印度、中国等发展中国家。糖尿病人的一个特殊问题是足部及下肢发生溃疡，简称糖尿病足(干性坏疽)。周边神经病变、肢端缺血和感染是三个主要的致病因素。其发病率随着患者年龄增加而增大，多发于40岁以上的患者中。糖尿病足很难治愈，目前临床主要有维持、预防感染和营养神经三种治疗方法，但都无法从根本上使组织再生，促进创面愈合。病人的溃疡长期不能愈合，甚至迟迟无皮肤生长的现象，并发感染，最终的结果是截肢。据统计，美国每年由各种类型糖尿病导致截肢的有5.6万人，单是住院治疗和截肢的总费用平均每人就需要4万美元，为此美国每年支出的医疗费用超过22亿美元，给家庭和社会带来极大负担。而血小板源生长因子可以促进创面组织再生，增加糖尿病足的治愈率，降低截肢的危险。血小板源生长因子(Platelet-Derived Growth Factor，以下简称PDGF)是一种通常储存于血小板α颗粒中的碱性蛋白质，由血小板、趋化到受损部位的巨噬细胞、受损血管附近的平滑肌细胞和受损部位的血管内皮细胞等多种细胞所分泌，具有促进中胚层源细胞分裂；刺激白细胞、平滑肌细胞、单核细胞和成纤维细胞的趋化作用；参与创伤修复过程中的炎症的反应，参与组织和细胞的分化与增殖过程；对正常和病理状态下的创伤修复有促进作用等。PDGF是由A、B两种单体构成的二聚体结构，其分子量为28-31KDa，可形成PDGF-AA，BB和AB三种异构体，在人类血小板来源中约85％-90％为AB型(分子量为22.5KDa，其中A链为13.3KDa，B链为12.2KDa)，约10％-15％为BB型。老年人的血小板也可含有多量的PDGF-BB，高达30％，而新鲜的血小板也可含有高达27％PDGF-AA。PDGF亚型的浓度是直接与创口愈合过程相关的。本发明的发酵工艺涉及的是重组血小板源生长因子为PDGF-BB型(以下简称为rhPDGF-BB)。大量研究表明，慢性伤口如糖尿病足部溃疡、压迫性溃疡的微环境中缺乏活性生长因子是造成它们难以愈合的主要原因。因此在这一领域中生长因子的潜在治疗作用开始受到人们的广泛关注。有关PDGF，EGF，TGF等生长因子的治疗作用迅速展开。实验表明PDGF是创伤愈合过程中较早出现的生长因子之一，在创面愈合的全过程中起重要作用，参与创口愈合的全过程。特别是针对慢性难愈性疾病如糖尿病溃疡，慢性静脉性溃疡，褥疮，放射性溃疡等效果显著。另外，血小板是进入创口的第一个细胞成分，通过释放生长因子促进平滑肌细胞胶原蛋白的合成来启动创口愈合过程。因此理论上说，PDGF应该对所有创面愈合均有促进作用，包括烧伤、烫伤、手术创口、皮外伤等急性创伤及对慢性静脉溃疡、褥疮、放射性溃疡等均有促进愈合作用。在各种疤痕的治疗方面，PDGF也显示了良好的效果，现在已经有一系列基于PDGF的用于治疗唑疮等留下的疤痕的修复用化妆品相继问世。到目前为止，PDGF是国外唯一一个在三期临床上证明有效并已作为药物上市的生长因子。1997年12月16日，美国食品及药品管理局批准Ortho-McNeil公司生产的REGRANEX药物上市，Regranex的有效活性成分是Becaplermin(0.01％)，即人重组血小板源生长因子(PDGF-BB)。Becaplermin由重组DNA技术在酵母菌中表达生产，原料Becaplermin由美国Chiron公司生产(U.S.LicenseNo.1106，Emeryville，CA 94608)；Regranex由Ortho-McNeilPharmaceutical公司推向市场(U.S.License No.1196，San German，Puerto Rico 00683)，用来治疗皮下深层、有充足血管供应的糖尿病足部溃疡。关于rhPDGF-BB的发酵工艺，据有文献报道，有人采用Pichiapastoris酵母表达系统，该系统是一种较为先进的甲基营养型酵母系统，经过十年的发展，已成为较完善的外源基因表达系统。它具有易于高密度发酵，表达基因稳定地整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌至胞外部并适当糖基化，培养方便经济等特点，而且非常适宜于扩大为工业规模。目前美国FDA已经评价来自该系统的基因工程产品，该系统被认为是安全的。(文献来自High Yield Production fromPichia pastoris YeastA Protocol for Benchtop FermentationBy Julia Cino，PhD httpwww.nbsc.com/papers/ABL_Pichia.htm)但是根据这个文献的报导，表达外源蛋白一般需要经过100-140个小时左右达到高峰。而本发明提供的发酵方法使得重组血小板源生长因子的蛋白表达量在诱导48-72小时后就已经达到高峰。


本发明的目的是提供一种新的发酵生产重组人血小板源生长因子(rhPDGF-BB)的方法，包括1)构建含重组血小板源生长因子目的基因的高效表达工程菌株，2)一级种子的培养，3)二级种子的培养，4)上罐发酵，5)收集上清，进行纯化，其特征在于，其特征在于，在上罐发酵过程中，参数设置为pH值为4.5-6.5，溶氧值为不小于18％，生长期温度为28℃-30℃，诱导期温度为18℃-23℃。通过该方法可以有效地缩短表达外源蛋白达到高峰所需要的时间，据有关文献报道，使用Pichia pastoris酵母表达系统表达外源蛋白一般需要经过100-140个小时左右才可以达到高峰。而本发明所提供的rhPDGF-BB发酵方法使得重组血小板源生长因子的蛋白表达量在诱导48-72小时后就已经达到高峰，这样就大大地缩短了发酵所需要的时间。同时纯化获得的rhPDGF-BB的纯度为大于95％，活性大于6×104μ/mg。
本发明提供的技术方案为提供一种新的发酵生产重组人血小板源生长因子(rhPDGF-BB)的方法，包括1)构建含重组血小板源生长因子目的基因的高效表达工程菌株，2)一级种子的培养，3)二级种子的培养，4)上罐发酵，5)收集上清，进行纯化，其特征在于，在上罐发酵过程中，参数设置为pH值为4.5-6.5，溶氧值为不小于18％，生长期温度为28℃-30℃，诱导期温度为18℃-23℃。
下面对本发明的技术方案进行具体地描述。
本发明提供的发酵方法适用于常规分子生物学技术构建的PDGF-B的工程菌株。具体地，本发明提供的工程菌为，将PDGF-B基因正确置于酵母表达载体pPICZ-αA，转化酵母菌株SMD1168H，经筛选建立分泌表达rhPDGF-BB的工程菌株。
然后通过常规的生产技术，进行菌株的活化，即将冻存的甘油管菌株，挑取少许涂入培养基(YPDS)中，30℃培养3天，菌落形态饱满，取出4℃保存。
一级种子的制备，挑取平板种子接种到三角瓶培养基(YPDS+Zeocin)，30℃，250转/分，培养20-24小时。OD600为2-4。
二级种子的制备，以10％的接种量接种二级种子，培养基为BMG，30℃，250转/分，培养20小时。0D600为4-6。
上罐发酵过程1)10L发酵培养基组成称取CaSO46.98g，K2SO4136.5g，MgSO4111.75g，KOH 30.98g，甘油300g，溶于8L水中，加入浓H3PO4200 ml，定溶10L；2)待发酵罐灭菌，降温至30℃，调整参数，PH值为5.5，按10％的接种量接种；3)生长阶段，在基础料中生长20-23个小时，补50％甘油5-7个小时；4)饥饿期约3-5小时；5)诱导期，降温至18-25℃，开始补100％甲醇48小时；6)发酵过程中，工艺参数的控制为pH值为4.5-6.5，溶氧值为不小于18％，生长期温度为28℃-30℃，诱导期温度为18℃-23℃。
本发明采用的培养基为无机培养基FBS，该培养基与有机培养基相比表达量相近，且成为较低，利于纯化。
本发明使用的发酵罐为B.Bruan公司生产的Biostat?D型发酵罐。本发明提供的发酵生产rhPDGF-BB的工艺，适用于市场上出售的任何厂家生产的发酵罐。
收集上清，经过纯化，进行中间体和最终产物的检测，结果如下，如图2所示，经过SDS-PAGE法检测，rhPDGF-BB蛋白表达量在诱导48-72小时后就已经达到高峰。如图3所示，通过常规细胞学实验检测rhPDGF-BB的活性在诱导48-72小时后已经达到高峰。纯化样品经过HPLC法检测，其纯度大于95％，经常规细胞学实验检测rhPDGF-BB的活性大于6×104μ/mg。


附图1 rhPDGF-BB发酵过程参数变化曲线图附图2 rhPDGF-BB发酵过程不同时间取样电泳图附图3 rhPDGF-BB发酵过程不同时间取样活性检测图
实施例1 工程菌株的构建利用常规的DNA重组技术将PDGF-B基因正确置于酵母表达载体pPICZ-αA，转化酵母菌株SMD1168H，经筛选建立分泌表达rhPDGF-BB的工程菌株。参考书有《分子克隆技术指南》，《分子生物学技术指南》。
实施例2工程菌株的活化1)平板培养基的组成含1％的酵母粉()，2％的蛋白胨，1.6％的琼脂，2％的葡萄糖(用前鲜加)。
2)冻存的甘油管菌株，挑取少许涂入上述的培养基中，30℃培养3天，菌落形态饱满，取出4℃保存。
实施例3一级种子的制备1)培养基的组成1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖(用前鲜加)。
2)挑取平板种子接种上述的三角瓶培养基，30℃，250转/分，培养24小时。OD600为4.0。
实施例4二级种子的制备1)培养基的组成组分贮存液13.4％基础氮碱(YNB)134g YNB溶于1000ml蒸馏水，过滤除菌；O.02％生物素(Biotin)20mg生物素溶于100ml蒸馏水，过滤除菌；10％甘油100ml甘油与900ml蒸馏水混合，121℃灭菌20分钟；1M磷酸缓冲液(pH6.0)1M K2HPO4132ml与1M KH2PO4868ml混匀后，调pH至6.0，湿热灭菌20分钟；以上贮存液均置4℃保存。
配制方法1/10体积的13.4％YNB，1/500体积的0.02％B和1/10体积的10％GY，1/10体积的1M磷酸缓冲液，用无菌水补足体积，4℃保存。
2)一级种子，以10％的接种量接种二级种子，30℃，250转/分，培养20小时。OD600为6.0。
实施例5上罐培养1)10L发酵培养基组成称取CaSO46.98g，K2SO4136.5g，MgSO4111.75g，KOH 30.98g，甘油300g，溶于8L水中，加入浓H3PO4200ml，定溶10L。
2)待发酵罐灭菌，降温至30℃，在罐上的控制参数调整好的情况下，按10％的接种量接种。
3)生长阶段接种后，约有2小时适应期，在此过程中，发酵参数基本不变，2小时后，pH值慢慢降低，低于5.0时由氨水来调节；当溶氧值低于18％时，通过搅拌的提升或通空气量的增加，来满足需求。到大约23个小时期间，补充50％的甘油于罐中，约7小时，菌体湿重约得到350g/L；4)饥饿期约5小时；5)诱导期，降温至20℃，开始补100％甲醇48小时；6)离心发酵液，收集上清，进行纯化。
实施例6检测结果及结论如图2 rhPDGF-BB发酵过程不同时间取样电泳图所示，经过SDS-PAGE法检测，rhPDGF-BB蛋白表达量在诱导48小时后就已经达到高峰。
如图3rhPDGF-BB发酵过程不同时间取样活性检测图所示，通过常规细胞学实验检测rhPDGF-BB的活性在诱导48小时后已经达到高峰。
纯化样品经过HPLC法检测，其纯度大于95％，经常规细胞学实验检测rhPDGF-BB的活性大于6×104μ/mg。


本发明涉及一种发酵生产重组人血小板源生长因子(rhPDGF－BB)的方法。此法包括1)构建含重组血小板源生长因子目的基因的高效表达工程菌株，2)一级种子的培养，3)二级种子的培养，4)上罐发酵，5)收集上清，进行纯化，通过本发明提供的发酵生产rhPDGF－BB的方法，大大地缩短了蛋白表达高峰的时间。