专利名称：Pdk3基因及其表达产物的应用的制作方法肝癌的治疗在过去20年里取得了很大的进展，出现了一些局部非手术治疗方案。例如，经导管动脉内化疗栓塞(TACE)，是中晚期肝癌治疗的重要手段，可使90%以上的肝癌患者受益；经皮肝穿刺瘤内无水乙醇治疗(PEI)，也是常用的局部化疗方法，对癌直径小于3厘米的肝癌及门静脉癌栓有一定疗效。但是，由于目前肝癌的化疗药物基本沿用其他肿瘤的治疗药物，针对性较差，因此，总体疗效不佳，迫切需要寻找新的作用靶点，研究和开发肝癌特异的新药物，以提高化疗的特异性和有效性。 蛋白激酶是由人类基因组中最大的一类基因所编码的，其作用是通过将磷酸基团转移至底物蛋白上，来调控各种蛋白的活性、信号转导通路及细胞生物学过程。目前已知的原癌基因中，大约有55%编码蛋白激酶，其余的多数编码可激活蛋白质激酶或被激酶磷酸化的特异蛋白。制药公司已认识到了蛋白激酶抑制剂的重要性，正在积极研发新的蛋白激酶抑制剂，用于治疗包括肿瘤在内的各种疾病。丙酮酸盐脱氢酶(TOH)复合物是一种细胞核内编码的线粒体多酶复合物，催化丙酮酸盐完全转化为acetyl-CoA and C0(2)，它提供了糖酵解与三羧酸循环之间的关键联系，因此也是负责调控葡萄糖代谢的主要酶之一。PDH的酶活性受到磷酸化/去磷酸化的调控，磷酸化导致PDH的失活。PDK3(丙酮酸脱氢酶激酶，同工酶3)基因编码的蛋白是三种丙酮酸盐脱氢酶激酶之一，通过El alpha亚基的磷酸化抑制PDH复合物。
本发明要解决的技术问题之一是提供一种TOK3基因及其表达产物在制备治疗肝癌的药物中的应用。本发明要解决的技术问题之二是提供三对TOK3基因的siRNAs，用于制备治疗肝癌的药物。为解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一个方面，提供了一种TOK3基因及其表达产物在制备治疗肝癌的药物中的应用。所述治疗肝癌的药物包括通过RNA干扰抑制TOK3基因表达的双链核糖核酸(包括该双链核糖核酸的不同修饰状态及不同递送方式)、DNA载体、腺病毒或腺相关病毒载体；能够特异性抑制TOK3基因激酶活性的化合物、多肽或单克隆抗体。在本发明的另一方面，提供了三对用于制备治疗肝癌药物的TOK3基因的siRNAs，其中，第一对siRNA的正义链具有如SEQ ID NO 1所示的序列，反义链具有如SEQ ID NO 2所示的序列；第二对siRNA的正义链具有如SEQ ID NO 3所示的序列，反义链具有如SEQID NO :4所示的序列；第三对siRNA的正义链具有如SEQ ID NO :5所示的序列，反义链具有如SEQ ID NO 6所示的序列。本发明实验证实，通过TOK3基因序列特异性siRNA干扰可以显著抑制肝癌细胞的生长，因此，PDK3基因可作为肝癌治疗药物的靶基因，为肝癌的防治提供新的途径。图I是实施例I的RNAi筛选步骤示意图；图2是实施例I的RNAi筛选数据处理过程图；图3是实施例I中，激酶siRNAs库对四株肝癌细胞H印3B、Huh-7, MHCC-97H、MHCC-97L生长活性影响分布图；图4是实施例I中，通过对四株肝癌细胞H印3B、Huh-7、MHCC-97H、MHCC-97L分别确定5%可信区间和10%分析区间，获得抑制、促进细胞生长的siRNAs及对应的激酶基因 的结果图；图5是实施例I中四株肝癌细胞H印3B、Huh-7、MHCC-97H、MHCC-97L全激酶组范围内RNAi对细胞活性影响的统计图；图6是实施例I的RNAi筛选体系鉴定干扰TOK3基因能够抑制肝癌细胞H印3B、Huh-7、MHCC-97H的生长示意图。实施例3免疫检测I.抗原蛋白获得从美国基因库Genebank中获得人TOK3基因的cDNA序列，通过PCR扩增获得编码框，插入原核生物或真核生物表达载体中，表达TOK3蛋白，并按基因工程表达产物的纯化体系纯化蛋白。2.抗体制备可采用以下几种方法制备抗体(I)细胞融合法用上述制备的TOK3蛋白免疫动物(包括兔子、山羊等)，获得脾脏细胞，再与骨髓瘤细胞融合，并按常规单克隆抗体制备技术制备单克 隆抗体。(2)利用噬菌体表面展示库，克隆免疫动物的脾脏IgG可变区并表达成基因工程单克隆抗体。(3)利用纯化的蛋白免疫动物，制备多抗血清。3.检测(I)用制备的抗体(多抗或单抗)，用组织化学方法进行肝癌的病理检测，阳性信号为肝癌。(2)取患者血清，用ELISA方法检测，阳性反应为肝癌可疑病人。(3)将TOK3抗体作为蛋白质芯片的探针之一，用于多种肿瘤诊断。实施例4TOK3基因的小干扰核糖核酸(siRNA)针对TOK3基因mRNA序列，设计并体外化学合成三对siRNAs，对应的靶序列分别如下sil-正义链CCGCAUCUCUUUCCGCAUGCUUAUU(SEQ ID NO: I)；sil-反义链AAUAAGCAUGCGGAAAGAGAUGCGG(SEQ ID NO 2)；si2-正义链AGAUCUGAAACUGUAUUCCAUGGAA(SEQ ID NO 3)；si2-反义链UUCCAUGGAAUACA⑶UUCAGAUCU(SEQ ID NO 4)；si3-正义链GCCUGAAGCCGAUGAUUGGAGCAAU(SEQ ID NO 5)；si3-反义链AUUGCUCCAAUCAUCGGCUUCAGGC(SEQ ID NO 6)；另外，设置无关序列作为阴性对照s i RNA :正义链5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’ (SEQ ID NO :7)；反义链5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’ (SEQ ID NO :8)。在96孔板中每孔接种3 X IO3个Huh_7，H印3B，MHCC_97H和MHCC-97L细胞(无血清培养液)。待细胞密度达到40%左右时，利用脂质体(LipOfectamine2000)转染试剂，分别将上述3种siRNAs按终浓度50nmol/L转染进Huh_7、H印3B、MHCC_97H和MHCC-97L细胞中，4小时后换成含10%胎牛血清的DMEM。以24小时为I个检测单位，培养7天，每天检测I次该细胞密度。每孔待测细胞液中加IOy L CCK-8，37°C孵育I小时。利用酶标仪在450nm波长下检测其吸光度，以代表细胞存活能力，绘制生长曲线。实验结果表明特异性干扰TOK3表达的siRNA能够抑制肝癌细胞系Huh-7，H印3B，MHCC-97H的生长，肝癌细胞的存活率明显低于对照组的细胞，说明人TOK3基因的表达下调能在一定程度上抑制肝癌细胞生长。


本发明公开了一种PDK3基因及其表达产物的应用，用于制备治疗肝癌的药物。本发明的PDK3基因及其表达产物可作为制备治疗肝癌药物的靶基因，为肝癌的治疗提供新的途径。