专利名称：治疗增生性疾病的腺病毒载体与p53基因的基因重组药物的制作方法图1)。将构建好的重组载体pGT-2和p53复合基因共转染大肠杆菌株BJ5183，使二者发生同源重组。同上，阳性克隆经扩增、PCR筛选和酶切鉴定。获得重组载体pGT-3，该载体中含有腺病毒5大部分序列(其E1区及上游部分序列被p53基因表达盒置换)。重组载体pGT-3经PacI酶切线性化，去除来源于pUC18的载体序列，转染293细胞(赛百诺公司冻存，保存号E-393)培养。在细胞内包装成含有腺病毒顺式活化序列(cis-acting sequence)与LTR的启动子操纵的人肿瘤抑制基因p53。组建成转染效率高、可操作性强、由单启动子控制的基因重组药物。该基因重组药物具有下列特点它是由腺病毒载体和p53基因人工表达盒两部分构成，1、结构特点其本质是一个活的重组腺病毒体，不同于现有的化学合成药物、中药、基因工程药物，是直接实现目的基因的体内表达，生物学活性高，可有效达到治疗作用；腺病毒载体能携带较大的基因、转染率高、可制备高效价的病毒颗粒，宿主范围广，安全性好，致病性低，尤其是经改建后的腺病毒载体免疫原性大大下降，使目的基因易于在机体内稳定、持久表达；p53基因人工表达盒是用腺病毒载体单启动子直接调控p53基因的表达，且有完整的多聚腺苷酸加尾信号，从而构成一个完整的表达盒(expression cassette)，可调控p53基因在靶细胞中高效表达。2、应用特点该基因重组药物除具有对各种恶性肿瘤的治疗作用外，对各种增生性疾病具有肯定的治疗作用，它可诱导其异常增生细胞表达正常功能的P53蛋白，从而有效抑制细胞的增殖，达到治疗瘢痕疙瘩等增生性疾病的目的。本发明将该基因重组药物先转染到基因工程改造过的特定细胞中培养、繁殖，浓缩纯化成可用于临床的治疗增生性疾病的腺病毒载体与p53基因的基因重组药物注射液。其中本发明实验所用的293细胞系(ATCC CRL-1573，第32代次，1997年6月13日从ATCC订购)来源于经5型腺病毒(Ad5)DNA转化人胚胎肾上皮细胞获得，含有Ad5 5′端的11％的基因组(包括E1a)。该细胞对腺病毒的感染和生长是高度许可的。本发明的贡献在于，它利用人类肿瘤抑制基因p53能抑制多种异常增生细胞生长的特点，将其克隆到腺病毒E1-株，通过局部注射，使腺病毒有效地将p53基因导入增生组织，表达出P53蛋白后，抑制异常增生细胞的生长，使异常增生细胞出现生长阻滞或凋亡，从而达到抑制增生性疾病的目的。该发明同时也解决了由于P53蛋白半衰期短(约20分钟)、不稳定、无法体外制备成为重组基因工程产品的问题，即实现了p53基因的肿瘤和增生性疾病的治疗。该基因重组药物利用腺病毒携带人类肿瘤抑制基因p53，直接在异常增生细胞中表达，从而解决了由于P53蛋白不稳定、无法用基因工程的方法体外制备成重组基因工程产品的问题。用腺病毒进行增生性疾病治疗，病人可在体内持续、高效表达P53蛋白，并在蛋白质分子修饰程序上，如蛋白质磷酸化、蛋白质折叠以及多聚化等方面都具有与体内真核生物相同的特性。本发明的基因重组药物可直接介导p53基因在真核细胞中表达，也就是说可以直接导入增生局部让其表达，使受治疗者自身变成一个可生产人类肿瘤抑制因子P53蛋白的“源泉”。这种方法实现将外源p53基因的体内转移并在病人增生组织内高效表达而达到治疗目的，使得增生性疾病的基因治疗成为现实。
图2是本发明的基因重组药物的技术路线框图。
图3是基因重组药物经多次传代后，以5′CCACGACGGTGACA CGCTTC和5′CAAGCAAGGGTTCAAAGAC为引物，以p53cDNA为模版，通过PCR扩增得到的p53基因的琼脂糖凝胶电泳图，以鉴定其稳定性。
图4是基因重组药物(赛百诺公司冻存，保存号No-1，下同)感染293细胞后36小时，经细胞裂解、提取病毒DNA经PCR鉴定的琼脂糖凝胶分析结果。
图5是基因重组药物感染Hep-2和H1299细胞后36小时，经细胞裂解、提取后经Western blot分析结果。
图6是体外原代培养的瘢痕成纤维细胞。
图7是用S-P染色及真空负压法进行成纤维细胞的鉴定。
图8是基因重组药物对瘢痕成纤维细胞的体外杀伤效应的光学照片。
图9是基因重组药物对瘢痕成纤维细胞的体外杀伤效应的电镜照片。
图10是该基因重组药物对临床瘢痕疙瘩病人治疗作用的术前、术后对比照片。
实施例1如图1和图2所示，构建基因重组药物及鉴定1、已发表的p53基因cDNA全序列，设计合成两段引物5′ATGGAGGAGCCGCAGTCAGATC和5′ATATCTGCAGAATTCCAGCAC作为引物，两端分别引入linker序列。以HeLa细胞cDNA为模板，经PCR方法扩增得到人p53基因，其中，反应条件为第一循环94℃变性4分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸2分钟；以后各循环94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共30个循环。由此得到大量的p53基因，用琼脂糖凝胶电泳分析，回收得到p53基因全长，片段纯化后再用此酶切割p53基因，插入到同样酶切的pUC19载体中测序，测得编码区的碱基序列和和推导的氨基酸序列(与GenBank Acc XM_058834一致)，随后酶切回收。
2、PCR反应扩增LTR和PA序列，引物分别为5′TCTGACATGCGATGTCGACTCG，5′CGGCAGTGACCCGGAAAGCAG；5′TCACAGAGTGCATTGTGAGGG，5′GCTCTAGCGTGGGGATCCC。分别于5′引物和3′端引物引入linker序列。同上的退火条件下，PCR扩增LTR和PA序列，纯化后克隆测序验证。
3、PCR反应分开扩增腺病毒的E1序列，反应条件同上，两端引物分别引入Bam HI和Eco RI酶切位点，扩增后测序验证。
4、将1所得序列分别与2所得的两条序列进行PCR反应，反应条件同前，得到PCR拼接产物LTR-p53-PA，进一步测序验证。
5、将3所得序列与4所得序列LTR-p53-PA经T4 DNA粘接酶粘接，获得p53复合基因。
6、PCR反应分别扩增腺病毒两端IRT序列，反应条件同上，测序验证后分别将两段序列克隆到pUC18载体中构成重组载体pGT-1。
7、提取野生型腺病毒5(ATCC-VR-5，腺病毒株75，滴度10(6.75)TCID(50)/ml)DNA，与重组载体pGT-1共转染大肠杆菌BJ5183，经4℃孵育30分钟，42℃热休克50秒钟，再在4℃孵育1分钟，加1ml LB培养液1小时，将温育的工程菌转入含安卞青霉素的琼脂培养板，24小时后，用灭菌牙签挑取单个细菌克隆，然后放入干净的含有LB的培养瓶中，24小时后，按常规方法提取质粒，用PacI切割筛选，获得阳性克隆为pGT-2(含有Ad5全序列)。
8、将p53复合基因与重组载体pGT-2共转染大肠杆菌BJ5183，同上方法培养，筛选和鉴定，获得阳性克隆pGT-3，含有腺病毒全基因组序列及插入的p53基因表达盒，再用PacI酶切，使之线性化，去除来源于pUC18的载体序列。
9、将分离的阳性质粒线性化后经CsCl2纯化，经CaCl2方法转染293细胞。7天后，收集细胞，1000rpm离心15分钟，弃上清，细胞经37℃-80℃冻融，裂解三次，4000rpm离心30分钟，取上清，弃沉淀，上清经二次感染，扩增病毒，以同样方法裂解病毒，上清经CsCl2密度梯度离心，条件为4℃ 60000rpm，16小时。经7号注射针头取重组腺病毒体分离带。用Spectra MW6000透析袋在N1H缓冲液中透析4小时，整个过程保持4℃。取出病毒液，用0.25μm的滤膜过滤除菌，分装。于-80℃保存，一部分作空斑形成试验及病毒颗粒含量测定。
10、基因重组药物的结构稳定性鉴定，经多次传代后，提取其基因组DNA，以p53基因两端5′CCACGACGGTGACACGCTTC和5′CAAGCAAGGGT TCAAAGAC为引物，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果见图3；以基因重组药物表达装置两侧的腺病毒臂5′TTT CTC AGG TGT TTT CCG C和5′CAT CGT ACC TCAGCA CCT TC为引物，PCR鉴定结果见图4。以上结果均表明基因重组药物经多次传代后结构稳定。
11、基因重组药物介导的p53基因在Hep-2和H1299细胞的表达鉴定。用重组p53腺病毒体感染293细胞36小时后，常规方法裂解细胞，以P53蛋白特异性抗体进行western blot分析，结果见图5。
实施例2基因重组药物对体外原代培养的成纤维细胞杀伤作用瘢痕成纤维细胞的体外培养(见图6)将手术切除下的瘢痕皮肤，在无菌条件下剪成0.5-1cm3小块，立即投入含1000U/ml青、链霉素的培养液中。先将组织用PBS(含青霉素、链霉素)洗2次，去除脂肪及结缔组织，再用D-Hank液洗数次，至液体无油滴，不混浊，反复剪碎至1mm3的小块，加数滴血清于组织块上，然后将皮肤小块按适当间隔放置于培养瓶壁上，翻转培养瓶，使有组织块一面向上，加入含10％FBS的DMEM培养液(注意勿使组织与培养液接触！)，将有组织块的一面向上，入37℃，5％CO2培养箱中静置培养，6-8hr后，轻轻翻转培养瓶，3-4天内勿动，以后每3-4天换液一次，10天左右组织块周围长出细胞，并渐渐形成细胞晕，一个月左右细胞长满瓶，形成单层细胞。
采用S-P染色及真空负压法进行细胞类型鉴定样品制备用胰酶消化细胞后，制成10000个/ml的细胞悬液，将18×18mm的盖玻片放进55mm培养皿中，每张盖片上滴加两滴细胞悬液，置CO2培养箱中孵育6-8h，依次夹出盖玻片，PBS彻底清洗3次，置纯丙酮中，室温下固定15min后，PBS清洗3次。
用真空负压法进行S-P法免疫细胞化学染色(见图7)使盖玻片细胞面向上，置载玻片上，每张滴加50μl(鼠抗人)，阴性对照组加入等量的PBS。置真空负压箱中，抽负压至66.7KPa，10min后取出，PBS洗3次，各加50μl生物素标记的第二抗体，置真空负压箱10min后取出，PBS洗3次；各加50μl链霉素亲生物素蛋白-过氧化物酶溶液，置负压箱10min后取出PBS洗3次；各加10μl DAB溶液显色，室温下10min后，PBS洗3次，苏木素复染1min，1％酒精蓝化数秒，系列酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。
光镜下细胞形态变化的观察(见图8)在25cm2培养瓶中接种约5×105瘢痕成纤维细胞，培养24h后，换液，加基因重组药物按200MOI进行感染，24h，48h，72h后在光镜下观察细胞形态变化。
电镜下细胞结构的变化(见图9)在25cm2培养瓶中接种约5×105瘢痕成纤维细胞，培养24h后，换液，加基因重组药物按200MOI进行感染，培养48h。用胰酶消化、收集细胞悬液于事先制备好的琼脂管中，2000r/min离心15min，使细胞成团。用2％戊二醛及1％四氧化饿双重固定细胞。将琼脂包埋的细胞团块经脱水、环氧树脂渗透与包埋、超薄切片及染色后，在透射电镜下观察和照像。
实施例3该基因重组药物在基因治疗瘢痕临床研究中对瘢痕疙瘩的治疗作用。
如图10A、图10B所示，女性瘢痕疙瘩患者，左侧前胸曾因暗疮后瘢痕而手术，切除后复发瘤样瘢痕，术后局部复发3年，经激素等常规治疗无效，前胸瘢痕体积2×1×1cm3(见图10A)。经基因治疗4周后，前胸部瘢痕明显萎缩，体积明显缩小，局部组织发暗(见图10B)；除自限性发热外，未见其它明显的毒副作用。临床试验研究结果表明，基因重组药物治疗瘢痕疙瘩是安全有效的。


一种治疗增生性疾病的腺病毒载体与p53基因的基因重组药物，该基因重组药物是由腺病毒载体与p53人肿瘤抑制基因表达盒构建而成的融合序列。本发明将腺病毒载体与人p53基因在原核细胞(E.coli)中同源重组，获得腺病毒载体与人p53基因表达盒构建的基因重组药物。其人p53基因表达盒是由启动子－p53cDNA－多聚腺嘌呤核苷酸构成的特征序列。使用本发明的基因重组药物，可制备成临床级基因治疗制品，用于治疗如瘢痕疙瘩等增生性疾病。