专利名称：对冠心病和心血管事件风险的预测的制作方法对冠心病和心血管事件风险的预测相关申请的交叉参考本申请要求2009年3月10日提交的美国临时专利申请号61/159，077的权益，其通过引用全文纳入本文。冠心病(CAD)是工业国家中的首要致死原因，且其与流行的肥胖症和糖尿病一起作用，正迅速成为发展中国家的首要致死原因。CAD的遗传倾向已充分建立；已证明家族史是CAD的独立风险因子，特别是在早发形式中。尽管这样，CAD的遗传结构仍然基本未知。许多已接受的CAD风险因子是代谢物。然而，对CAD风险的理解仍是不完整、机械化的，而且同样重要的是需要改进我们鉴别心血管事件最大风险个体的能力。由于CAD的复杂性质，应用更全面的手段评估可改进风险分级并提高我们对疾病过程的理解。发明概述—方面，提供评估对象心血管疾病风险的方法。所述风险评估可包括预测随后心血管事件如心肌梗塞的可能性、预测CAD的发展或识别对象中CAD的存在。本方法包括检测来自对象的样品中至少一种代谢物。所述代谢物可为酰基肉碱、氨基酸、酮、游离脂肪酸或羟基丁酸盐。然后，将代谢物水平与标准或对照对象作比较并可用于确定对象中心血管事件的风险、CAD发展的风险或CAD的存在。另一方面，还提供针对患有CAD或有发展风险的对象或面临心血管事件风险的对象开发治疗计划的方法。所述方法包括使用检测的对象代谢物水平开发基于对象心血管疾病风险的治疗计划。所述计划可包括饮食、运动和药物治疗选择。另一方面，提供评估对象心血管疾病风险的方法，其中样品获自所述对象。所述样品提供给实验室用于检测样品中的代谢物水平。检测的代谢物可为酰基肉碱、氨基酸、酮、 脂肪酸或羟基丁酸盐。该试验室返回表明所述样品中代谢物水平的报告，其指示所述对象心血管疾病的风险。附图简要说明图1是代谢物因子和CAD的受体操作特性(ROC)曲线的组图。ROC曲线和模型拟合(c统计量)用三种模型表示包括传统CAD风险因子(糖尿病、高血压、血脂障碍、吸烟、 ΒΜΙ、家族史；而对于重复组，还包括年龄、种族和性别)的临床模型(黑线)；包括所有传统风险因子和代谢物因子4和9的模型(灰线)；和包括所有传统风险因子和所有代谢物因子的模型(黑色虚线)。上图显示初始组，下图显示重复组。图2显示代谢物因子8预测心血管事件的能力的cox比例危险模型。显示代谢物因子8的未调整(左图)和调整(右图)存活曲线(根据BMI、CAD严重性、高血压、血脂障碍、糖尿病、吸烟、家族史、射血分数、血清肌酸酐、并发CABG、年龄、种族、和性别进行调整)。图3是所述8个多重GENECARD家族的家谱。黑色实心符号表示受到早期CAD影响；较小的灰色圆圈表示为本研究进行血液概况分析。应注意大多数分析特征的家族成员为最初患病同胞配对的至今未受影响的后代。图4显示常规代谢物的遗传率。Y轴为-Iogltl(遗传力估值(X轴)的P值)。遗传力点估值周围的误差线为浅灰色。图5显示氨基酸和游离脂肪酸的遗传力。所示为氨基酸和游离脂肪酸的遗传力。 Y轴为-Iogltl (遗传力估值(X轴)的P值)。遗传力点估值周围的误差线为浅灰色。图6显示酰基肉碱的遗传力。Y轴为-Iogltl (遗传力估值(X轴)的ρ值)。遗传力点估值周围的误差线为浅灰色。发明详述代谢组学研究小分子代谢物，可用于人疾病的诊断。研究已证明植物和小鼠代谢物的遗传力。如实施例所述，代谢物特征在具有早发CAD的人类家族中是可遗传的，说明 CAD的已知遗传力可能至少部分通过血液中可测量的代谢组分介导。本实施例描述编入杜克大学(Duke)CATHGEN生物样品库(bior印ository)的参与者和选自杜克大学GENECARD 研究的家族中69种代谢物的定量概况，包括酰基肉碱种类(线粒体脂肪酸、糖和氨基酸氧化的副产物)、氨基酸和常见代谢物如游离脂肪酸、酮、和β -羟基丁酸盐。本文提供代谢物特性能评估对象的心血管疾病风险。本实施例证明单独或联合作用的具体代谢物的水平可判别发展CAD、CAD存在的可能性和随后的心血管事件的风险。提供评估或预测对象心血管疾病风险的方法。本方法包括检测来自对象的样品中至少一种代谢物的水平。可检测所述代谢物的含量或相对水平。检测的代谢物可为酰基肉碱、氨基酸、酮、游离脂肪酸(FFA)或羟基丁酸盐。然后用来自对象样品中的代谢物水平和标准作比较以评估心血管疾病的风险。所述标准可为源自经验的各代谢物数量，其表明正常范围和/或指示心血管疾病的范围，或可直接与已知心血管疾病状态的个体的代谢物水平作比较。提供方法用于通过从对象获取样品并将其提供给实验室以检测样品中代谢物水平来评估对象心血管疾病风险。如上所述，实验室检测的代谢物可包括酰基肉碱、氨基酸、 酮、脂肪酸和羟基丁酸盐。然后接受来自实验室的说明样品代谢物水平的报告。所述报告表明对象代谢物水平且所述水平可用于与标准值比较以指示对象心血管疾病风险。心血管疾病风险包括评估无CAD对象由于遗传因子而随着时间发展出CAD的风险、评估对象是否存在CAD和评估发生心血管事件的风险。心血管事件包括心肌梗塞、中风和死亡。对象可为任何哺乳动物，对象优选是人。鉴定为患有CAD或有发展CAD风险的对象可用本文所述方法进一步评估以测定其心血管事件的风险。所述方法可用于以非侵入方式协助诊断CAD的存在，和/或用于开发针对鉴定为有CAD风险、患有CAD或有心血管事件风险的对象的治疗计划。所述治疗计划可包括给对象提供饮食、运动和药物治疗。心血管事件包括但不限于心肌梗塞(Ml)、中风和死亡。所述代谢物可用不同样品检测，本领域技术人员了解其中数种。在本实施例中，获取对象的外周血并处理以检测对象代谢物水平。也可用对象的其他组织或液体，包括但不限于血液、血浆、尿液、血清、唾液和组织活检。可用任何方法检测代谢物。所述方法优选定量从而可测定对象或来自对象的样品中的代谢物水平或含量。在本实施例中，所述代谢物水平用质谱检测。也可用其他测量方法，包括核磁共振(NMR)。检测所述代谢物也可用基于通过如结合或酶实验的代谢物检测的比色或荧光实验。可使用针对代谢物的任何合适的实验方法。本领域技术人员了解这类方法。对象的代谢物水平可以血液或组织中代谢物的ng/ml形式报道，通过血液或组织中代谢物的mM或μ M浓度或通过使用任意单位来表示对象中的相对水平。在本实施例中，报道血液中代谢物的mM或μΜ。在一些实施方式中，单一代谢物的检测足以评估心血管疾病的风险。在一些实施方式中，可检测并在评估心血管疾病风险的方法中使用2、3、4、5、7、10、15、20、25、30、35、 40、45、50、55、60或65种代谢物。检测的代谢物可通过对象群体的主要成分分析与因子相关。在下述实施例中描述用于评估CAD遗传力和CAD存在或有心血管事件风险的因子或代谢物组。对象代谢物水平用于检测对象是否患有CAD、对象发展出CAD的风险和/或对象未来经历心血管事件的风险。风险测定水平可基于血液中代谢物的标准水平。所述标准用于HDL和LDL胆固醇测量之间的关系，其中当禁食后血液中胆固醇水平达到特定水平且HDL 与LDL的比例超过标准限制时预测CAD风险。所述标准一般基于大群体研究开发。或者， 风险测定可基于直接与一个或更多对照对象相比。例如，无CAD且样品获取后两年内无心血管事件的对照组对象和患有CAD且样品获取后两年内有或没有心血管事件的对照组对象可用作比对。所述对象心血管疾病的风险可用相对形式表示。例如正常水平的代谢物可用1.0 表示对象从低到平均的心血管疾病风险如CAD或心血管事件。任何低于1. 0的数值可表明该对象的风险低于普通人群风险。高于1. 0的数值表明该对象的风险高于平均风险水平且实际数值可涉及风险水平。例如，代谢物水平为2. 0的对象在接下来的两年内经历心血管事件的可能性是平均个体的两倍。心血管疾病(包括CAD或未来的心血管事件)的风险评估包括但不限于开发风险概况。所述评估或预测可表明所述对象比对照对象有10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、 70 %, 80 %, 90 % UOO %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 750 % ^； 1000% 可能性更容易患或发展出心血管疾病如CAD或有心血管事件。对照对象是没有CAD的个体且具有与CAD或心血管事件的风险升高不相关联的代谢物水平。预测发展出心血管疾病CAD的风险的代谢物包括涉及脂、蛋白质和糖代谢的许多主要途径的代谢物。因此，酰基肉碱包括葡萄糖、脂肪酸和氨基酸代谢副产物乙酰基肉碱 (C2)、提供氨基酸分解代谢信息的丙酰基肉碱(O)和异戊馅肉碱(C5)、报告过氧化物酶脂肪酸代谢的二羧酸盐酰基肉碱、和长链脂肪酸β氧化的中间体中长链酰基肉碱。所述氨基酸在蛋白质周转和分解代谢中作为重要的中间体，而所述酮是脂肪酸β氧化的指标。下述表1显示本实施例中测试的代谢物的缩写名和全名。表2显示各所测代谢物的生物功能 (如果有)。表1.代谢物命名和个体内变化。给出代谢物缩写名、全名和个体内变化测量。缩写名代谢物全名个体内变化测量R2CVC2乙酰基肉碱0.845.16C3丙酰基肉碱0.7522.95C4:Ci4丁酰基肉碱或异丁酰基肉碱0.7513.48C5:l甲基巴豆酰基肉碱0.4611.24C5异戊酰基肉碱、3-甲基丁酰基肉碱或2-甲基丁酰基肉碱0.5113.08C4-OHP-羟基-丁酰基肉碱0.4015.46Ci4-DC:C4DC甲基丙二酰基肉碱或琥珀酰基肉碱NANAC8:l辛烯酰基肉碱0.8611.29C8辛酰基肉碱0.964.49C8:l-OH/C6:l-DC3-羟基-顺-5-辛烯酰基肉碱或己烯二酰基肉碱NANAC8:1-DC辛烯二酰基肉碱NANAC5-DC戊二酰基肉碱0.6010.33C6-DC己二酰基肉碱0.5413.33C10:3癸烷三酰基肉碱0.748.78C10:l癸烯酰基肉碱0.993.57ClO癸酰基肉碱0.908.3C100H:C8DC3-羟基-癸酰基肉碱或辛二酰基肉碱0.916.47C12:l十二烯酰基肉碱0.918.07C12月桂酰基肉碱0.4812.54C120H:C10DC3-经基-十二烷酰基肉碱或癸二酰基肉碱0.943.16C14:2十四碳二烯酰基肉碱0.894.25C14:l十四碳稀酖基肉碱0.744.62C14:l-OH3-羟基-十四碳烯酰基肉碱0.744.8C14-OH:12-DC3-羟基-十四碳酰基肉碱或十二碳二.酰基肉碱0.684.91C16棕榈酰基肉碱0.367.83C16-OH.C14-DC3-羟基-十六烷酰基肉碱或十四碳二.酰基肉碱0.953.98C16:2十六碳二烯酰肉碱NANAC16:l棕榈油酰基肉碱NANAC16:l-OH/C14:l-DC3-羟基-棕榈油酰基肉碱或顺-5-十四烯二酰基肉碱NANAC18:2亚油酰基肉碱0.844.33C18:l油酰基肉碱0.904.77C18硬脂酰基肉碱0.536.08C18:2-OH3-羟基-亚油酰基肉碱NANAC18:l-OH3-羟基-十八烯酰基肉碱NANAC16-OH:C14-DC3-羟基-十把烷酰基肉碱或十六碳二酰基肉碱，它普酞基肉碱0.707.91C20花生酰基肉碱、二十烷酰基肉碱0.654.49C20:1-OH/C18:1-DC十八烯二烯酰基肉碱0.668.46C20-OH:C18-DC3-羟基-二十烷酰基肉碱或十八碳二.酰基肉碱0.399.42C20:4花生西烯酰基肉碱NAKAC22乳酰基肉碱，二十二烷酰基肉碱0.845.16GLY甘氨酸0.851.36ALA丙氨酸0.970.49SER丝氨酸0.792.14PRO脯氨酸0.681.11VAL缬氨酸0.841.25LEU/ILE亮氨酸/异亮氨酸0.950.79MET甲硫氨酸0.951.45HIS组氨酸0.332.04PHE苯丙氨酸0.950.72TYR酪氨酸0.941.61ASX天冬氨酸/天冬酰胺0.881.55GLX谷氨酜胺/谷氨酸0.552.33ORN鸟氨酸0.861.54CIT瓜氨酸0.574.69ARG精氨酸0.981.37FFA总游离脂肪酸0.9914.1HBUTβ-羟基丁酸盐0.904.8KET酮0.913.7 表2.所测代谢物的生物功能。通过测量常规代谢物如脂肪酸、酮和β -羟基丁酸盐以及大量酰基肉碱和15种生物相关的氨基酸，调查的代谢物组报道了脂、蛋白质和糖代谢的主要途径。此表显示测量的各个体代谢物的生物功能(如果有)。
本文公开通过检测来自对象的样品中至少一种代谢物水平来评估其心血管疾病风险的方法。所述代谢物水平表明该对象心血管疾病的风险。所述代谢物可为酰基肉碱、氨基酸、酮、游离脂肪酸或羟基丁酸盐。所述心血管疾病可以是心血管事件，发生冠心病的风险或冠心病发展的风险。