专利名称：一种高纯度河豚毒素的提取方法河豚毒素是海洋洄游鱼类河豚鱼中的特有成分，主要存在于卵巢、肝脏及血液中。 研究表明，在其它的鱼类、两栖类、软体动物、棘皮动物中，也发现有河豚毒素的存在，如虎虾鱼、蓝环章鱼、加州蟒螈等，甚至甲壳类蟹也有发现的报道，所以河豚毒素也称圆毒素、蟒螈毒素、东方豚毒素等。我国研究河豚毒素历史悠久，最早在《山海经》中就有记载，《神农本草经》、《开宝本草》、《本草纲目》等都有关于河豚的记载。自古以来河豚毒素就和人类结下了不解之缘，它可以做成水煎剂，在19世纪50年代就有广泛的应用。河豚毒素的化学研究始于1909年。1964年京都国际天然产物化学会议上，同时公布了美国、日本三个研究小组测定的正确分子结构(见右图)，是一种分子量不大但结构很复杂的笼形原酸酯类生物碱。分子主要由3个氮原子组成，它们与氢氧原子形成特殊的结构，含有1个碳环、1个胍基、6个羟基，在C-5和C-IO位有一个半醛糖内酯连接着分开的环，据称是“自然界最奇特的分子之一”。河豚毒素的英文名称Tetrodotoxin，缩写作TTX。分子式C11H17N3O8，分子量 319.27。化学名称八氢-12-(羟甲基)-2-亚氨基_5，9，7，IOa-二甲基-10aH-[l，3] 二氧桥[6,5-d]嘧啶 _4，7，10，11，12-五醇。系统命名:0ctahydl0-12-(hydroxytnethyl)-2-imino-5,9,7,10a-dimenthano-10ah-[1,3]dioxocino[6,5-d]pyrimidinc-4,7,10,11, 12-pentolο河豚毒素是一种弱碱性动物生物碱，为非蛋白质神经毒素，有剧毒，其毒性比氰化钠还强1000倍。河豚毒素的作用机理是钠离子通道阻断，是药理学研究的工具药，还可以用作分子探针。河豚毒素最吸引科技人员研究开发的主要原因是它对药物滥用的脱瘾治疗，即快速生理脱毒的临床效果，尤其对海洛因的脱瘾治疗(5-7天)更显奇效。药物滥用是困扰世界的难题，变快的生活节奏、激烈的竞争带来的压力、家庭单位的小型化、人们对信仰的缺失、经济的快速发展和教育的滞后等，催生出一个庞大的毒品市场。由于贩毒所带来的高额利润回报，诱使很多不法分子铤而走险，使毒品走私国际化、集团化，毒品纯度越来越高。目前关于戒毒尚无良药，普遍采用替代递减疗法，即以小毒代大毒，以低毒代高毒，如丁丙诺非、美沙酮、路托菲、纳曲酮等，几乎都是阿片类受体激动剂，都有依赖性和较强的毒副作用。而河豚毒毒素是一种钠离子通道阻断剂，既通过神经中枢又通过外周神经、发挥与杜冷丁和阿司匹林不同的镇痛作用，有明显的拒抗阿片类药物所致的戒断综合症，是一种无成瘾性、无毒副作用的理想戒毒药物。河豚毒素不但可以用于治疗外伤性疼痛、神经性疼痛、癌症疼痛、术后疼痛，还有治疗皮肤病如湿疹、癣、疥等，还有去腐生新的作用如烧伤、烫伤、疖、痈等的治疗，在壮阳及治疗女性性冷淡方面也有良好的疗效，也有关于治疗高血压等相关的报道。关于河豚毒素的提取，最早源于日本从河豚鱼中提出粗品，我国也有很多关于河豚毒素提取的相关报道，其方法主要有树脂活性炭吸附法、二步树脂法、多级膜过滤法等等。但这些方法都是通过长期浸泡来制备河豚毒素原液，时间长易腐败。尽管可以采用了低温浸泡等措施，也很难避免药液和药渣腐败的现象发生。而碳柱吸附的方法，碳的前处理比较繁琐，同时存在碳对河豚毒素不可逆吸附的缺陷。另外，大型膜过滤方法对资金的需求较大，不易实现产业化。
本发明的目的是提供一种新型、高效的由动物原料提取高纯度单一物质，特别是一种由河豚鱼籽和肝脏中获得高纯度河豚毒素的提取方法，提高河豚鱼毒素的提取率、纯度、稳定性和效率，简化提取工艺。为实现上述目的，本发明采用的工艺步骤包括超声波快速溶出、有机溶剂脱脂、 板框多级过滤、阳离子离子交换树脂、小型膜过滤及高效液相制备等方法，对河豚毒素进行提取、分离、制备，获得高纯度、高稳定性河豚毒素单体。本发明首先采用超声波，以加速有效成份的溶解过程，将原来几乎一周的浸泡时间缩减至几个小时以内，避免了料液的腐败。在板框过滤前用有机溶剂对料液进行脱脂处理，使板框过滤机的效率大幅度提高，并避免了对膜元件进行再生处理的弊端。板框两级过滤并使用微孔滤膜，去除料液中的悬浮物、细胞碎片等非有效成分，为后面的分离工序创造有利条件。运用离子交换将料液体积减少了 50-100倍的同时，使有效成分得到富集。离子交换吸附后，用PH值2 5的醋酸洗脱，进一步将酸溶性杂质去除。用5-25%的醋酸将有效成分集中的洗脱下来，再采用小规模膜过滤的方法去除分子量大于1000和小于200的非有效成分，同时也完成了对料液的进一步脱水浓缩，避免了在后续的减压浓缩过程中有效成分长期受温度的影响，也进一步缩短了生产周期。采用高效液相色谱制备，使河豚毒素与其它组分进一步精确分离，特别是同系物及其异构体等非有效成分得以分离去除，最终获得纯度99%以上的河豚毒素高纯单体结晶。采用本发明提取的高纯度、高稳定度河豚毒素单体，可以作为河豚毒素注射液及其相关制剂的原料，在镇痛、戒毒等方面应用于临床。

将河豚鱼籽或肝脏分割成块或条，加1-2倍的去离子水，置于超声波中超声1-2小时，连续3-5次，至检测无河豚毒素止。超声后的料液置于甩水机中，将料液甩出。合并甩出料液，快速煮沸5-15分钟，快速冷却，用300-400目的滤布将蛋白等固形物滤出，将料液用二氯甲烷脱脂，再用板框过滤机用滤纸和微孔滤膜进行两级过滤，板框透过液转离子交换系统备用。b、离子交换将步骤a中经板框过滤后的原液，上离子交换柱进行离子交换，料液吸附完毕后用5-20%的醋酸开始洗脱，用动物法监测出毒时间，收集含毒液，洗脱至无毒完毕。C、膜过滤将步骤b中经离子交换后的收集液进入膜过滤系统直接进行超滤和纳滤，进一步对其进行脱水浓缩，去除分子量1000以上和200以下的非有效成分，减压浓缩至小体积备用。d.高效液相色谱制备将步骤c中经膜过滤后的料液用高效液相色谱制备，收集有效成分，低温减压浓缩，置冰箱中低温冷藏备用.e.结晶将步骤d中置冰箱冷藏后的液体，加8-15%的氨水调PH8-10，强力振摇，低温沉降后，得河豚毒素白色沉淀。将白色沉淀用离心机高速离心，经无水乙醇反复洗涤数次，减压干燥，得99 %以上的高纯度河豚毒素结晶。本发明所述的脱脂溶剂是二氯甲烷，还可以是三氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚等有机溶剂。所述的离子交换树脂为D152大孔丙烯酸阳离子交换树脂，所述的微孔滤膜和纳滤膜还可以是高分子复合膜、纤维素衍生物类膜，聚砜、聚芳砜类膜，聚酰胺、聚酰亚胺类膜，聚酯类膜、聚烯烃类膜、含氟聚合物膜等膜材料，微孔滤膜的孔径为0. 22-10微米。所述的洗脱液的为稀醋酸，其浓度为5-25%。所述的超滤和纳滤的温度为20-30°C，工作压力为10-20帕。所述的高效液相色谱制备柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为 0. 5-2/1000的磷酸盐缓冲液与适量甲醇的混合溶液。所述的低温沉降温度为0-10°C，所述的氨水的浓度为8-15%。为进一步说明本发明的一种高纯度河豚毒素的提取方法，下面以10公斤河豚鱼卵为例，对本发明做详尽阐述a、原液制备将河豚鱼籽10公斤切割成不规则的块或条，加2-5倍的去离子水，置超声波中超声1小时，连续3-5次，至检测无河豚毒素止。超声后的料液置于甩水机中，将料液甩出。合并料液，快速煮沸10分钟，快速冷却，用300-400目的滤布将蛋白等固形物滤出。将料用二氯甲烷将料液脱脂，再用板框过滤机两级过滤，板框透过液转离子交换系统用。b、离子交换将a步骤中经板框过滤后的料液，上离子交换柱进行离子交换，吸附结束后用 10%的醋酸开始洗脱，用动物法监测出毒时间，收集含毒液，洗脱至无毒完毕。在b步骤中树脂处理对树脂进行酸(0. Imol盐酸)碱(0. Imol氢氧化钠)处理后备用。装柱湿法装柱。
氨化用10%的氨水氨化。交换条件流速100-300ml/min，交换温度为室温。洗脱条件洗脱液为10%醋酸，洗脱速度30-50ml/min。收集分段收集，合并含毒收集液。C、膜过滤将将b步骤中经离子交换后的收集液，用小型膜过滤机进行超滤和纳滤，进一步对其进行脱水浓缩，并将分子量5000以上和200以下的非有效成分去除，减压浓缩至小体积备用。膜过滤条件工作温度25_30°C，工作压力15-20帕。d.高效液相色谱制备将c步骤中经膜过滤的料液用高效液相色谱制备，收集有效成分，50°C减压浓缩后，置冰箱中冷藏备用。在d步骤中色谱柱0DS柱检测器示差折光检测器流动相1-2/1000磷酸盐缓冲液与适量甲醇混合溶液。e.结晶将d步骤中置冰箱冷藏后的液体，加8-15%的氨水调PH8-10，强力振摇，低温沉降后，得河豚毒素白色沉淀，用离心机高速离心，沉淀经无水乙醇反复洗涤数次，减压干燥，得 99%以上的高纯度河豚毒素结晶。本发明工艺简单易行，提取成本降低，适于工业化推广。采用本发明提取的高纯度、高稳定度河豚毒素单体，可作为河豚毒素注射液及其相关制剂的原料，广泛用于临床。


本发明公开一种高纯度河豚毒素的提取方法，主要用于由动物原料河豚鱼籽和肝脏中提取河豚毒素，联合运用超声波快速溶出、有机溶剂脱脂、板框多级过滤、阳离子离子交换树脂、小型膜过滤及高效液相制备等方法，获得高纯度、高稳定性河豚毒素结晶。河豚毒素具有阻断钠离子通道的作用，镇痛效果明显，无依赖性，广泛用于癌症晚期、术后止疼以及药物滥用的脱瘾治疗等。高纯度河豚毒素的制备提取，为研制新型高效、无依赖性的镇痛新药提供可能。