专利名称：一种对玉米进行基因转化的方法图1为再生植株的hpt基因PCR分析电泳图。图2为再生植株的bar基因PCR分析电泳图。图3为再生植株的hpt基因Southern blotting分析结果图。图4为再生植株的bar基因Southern blotting分析结果图。表1、本发明所用农杆菌菌种及其质粒菌株菌种 质粒 携带基因抗生素(mg/l)LBA4404pTOK233 GUS HPT NPT II Hpt50LBA4404pAt5 GUS CryIB Bar NPT IIKan100EHA105 p1301GUS HPT NPT II Kan50LBA4404p3301GUS Bar NPT II Kan100EHA105 pMG8 Bar NPT II Kan100 Str253、生化试剂潮霉素购自BOEHRINGER MANNHEIM公司，噻孢霉素购自Sigma公司，除草剂购自日本明治公司，限制性内切酶、随机引物试剂盒购自promega公司，乙酰丁香酮(AS)购自Fluka公司，同位素购自亚辉生物医学工程公司，X-Gluc等其它试剂和药品购自国内外相关厂家和公司。选择剂的配制潮霉素(50mg/L)经0.22μm微孔过滤后，存于4℃；噻孢霉素(250mg/L)经0.22μm微孔过滤后，存于-20℃；除草剂用重蒸水配成PPT有效成分浓度为10mg/L，0.22μm微孔过滤后，存于室温。4、仪器PCR扩增仪(GeneAmp PCR System 9700)；PDS-1000/He型基因枪5、培养基(1)选择培养基的配制D培养基经高压灭菌后，冷却至50℃左右，加入潮霉素和噻孢霉素或除草剂和噻孢霉素配成一定浓度的选择培养基。
(2)其它培养基的配制如表2-表4所示表2、农杆菌YEB培养基及YEP培养基成分YEB 成分 YEP牛肉膏 5g/L NaCl 5g/L胰蛋白胨5g/L 胰蛋白胨 10g/L蔗糖5g/L 酵母提取物10g/L酵母提取物 5g/L pH7.0硫酸镁 0.5g/L 固体培养基加琼脂 15g/L表3、农杆菌AB培养基pH7.2成分 浓度 成分浓度KH2PO43g/L Cacl2·H2O0.012g/LNaHP4·2H2O 1g/L FeSO4·7H2O 0.0025g/LNH4Cl 1g/L 葡萄糖 5g/LMgSO4·7H2O 0.3g/L KCl 0.15g/L固体培养基加琼脂 15g/L表4、玉米幼胚、愈伤组织培养、转化、诱导胚状体及植株分化培养基用途 培养基植物激素 抗生素(mg/L)高渗预培养D+0.4M甘露醇 Dicamba15-30μM侵染 D-infDicamba15-30μM共培养D-AS Dicamba15-30μM愈伤诱导 DDicamba15-30μM Hpt15(PPT5)cef250
N6 2，4-D2mg/L选择 D1.5 Dicamba15-30μMHpt20(PPT10)cef250胚状体诱导 D1.5；DM 6-BA5mg/L cef100分化 RMcef100D-inf溶液N6大量元素、B5微量元素、RTV有机物、铁盐、蔗糖68克/升、葡萄糖36克/升、脯氨酸0.7克/升、水解酪蛋白0.5克/升、Dicamba15-30μM，pH5.2。
D培养基N6大量元素、B5微量元素、RTV有机物、蔗糖30克/升、L-脯氨酸0.7克/升、水解酪蛋白0.5克/升，琼脂8克/升、Dicamba15-30μM，硝酸银100μM，pH5.8。
6、PCR扩增引物1)hpt基因PCR扩增引物可扩增0.48kb片段，其序列是5’引物5’GGC GAA GAA TCT CGT GCT TTC A 3’3’引物5’CAG GAC ATT GTT GGA GCC GAA A 3’2)bar基因PCR扩增引物可扩增0.46kb片段，其序列是5’引物5’GCG GTC TGC ACC ATC GTC A 3’3’引物5’GTA CCG GCA GGC TGA AGT CCA 3’实施例1、农杆菌转化玉米幼胚1、植物受体材料的准备玉米试材播种后，按试验需要进行控制授粉，以取得相应的自交系材料或杂交种。授粉后6-13天，取玉米幼穗在超净工作台上剥去苞叶，取出幼胚。
2、农杆菌菌株的培养(1)菌株的保存方法用接种环挑取农杆菌的单菌落划线于添加相应抗生素的AB固体培养基上，于28℃的培养箱中培养3天，转入4℃的冰箱保存，每隔一个月继代一次。
(2)菌液的制备挑取继代3天后的农杆菌单菌落，在加有相应抗生素的液体YEB培养基中，以250rpm进行振荡培养，在28℃培养至对数生长期后，将菌液置于离心管中，在5000rpm下离心5min并收集菌体，将收集的菌体用添加100μM AS的D-inf液体培养基进行洗涤，以去除残余的YEB培养基，最后将农杆菌悬浮于添加100μM AS的D-inf中，OD值约0.3-0.4，备用。或用AB固体培养基培养2-3天，收集菌体，将收集的菌体用添加100μM AS的D-inf液体培养基进行洗涤，最后将农杆菌悬浮于添加100μM AS的D-inf中，OD值约0.3-0.4，放置半小时可用于转化。
3、感染和共培养将幼胚放置在高渗培养基上3-4小时，用D-inf洗一次，再浸入添加100μM的D-inf农杆菌菌液中，用振荡器振荡30秒，并放置5分种，取出用灭菌滤纸吸干，放到D-AS培养基上，在25℃黑暗共培养3天，并设对照。
4、农杆菌清除和转化受体的恢复把共培养3天后的幼胚移入含有250mg/L的噻孢霉素的无菌水中，洗涤1-3次，最后一次在含有250mg/L的噻孢霉素的无菌水中浸泡30分钟。取出植物材料，用无菌滤纸吸干，放至含250mg/L的噻孢霉素的愈伤诱导培养基上一周。
5、低压选择将转化受体移入加有含10mg/L潮霉素(PPT5mg/L)的筛选培养基LSD1.5上，低选择压下培养2周。
6、高压选择进行2-3轮20mg/L潮霉素(PPT10mg/L)高压选择，每轮3周。每次继代注意淘汰呈褐色和水渍化的愈伤组织，并把生长正常的愈伤组织用镊子夹碎，分开选择培养。
7、胚状体的诱导将选择到的抗性愈伤组织转到诱导胚状体培养基上，3周即可出现胚状体。
8、再生将形成胚状体的再转入到分化培养基上进行分化，培养条件为28℃，每日光照3000Lx光强光照16小时，很快就会有小苗再生出来。
9、幼苗锻炼再生的小植株长到3片叶时，可将幼苗分移植到罐头瓶中，并在室内培养。
10、再生苗第一次移栽待小苗长出新叶及根后，将幼苗从罐头瓶中取出，自来水冲净培养基，移栽于混有营养土和蛭石(1∶3)的小花盆中，最初3-5天，幼苗应遮上塑料薄膜，以保持湿度11、再生苗的第二次移栽当玉米苗又长出2-3片新叶时，可将其移入大田或大花盆中。得到的抗性植株数如表5所示。
自交系Z3、Z31、P9-10及杂交种F的再生植株大多数形态正常，雌雄穗正常，能够自交获得种子。自交系Q31的再生植株较矮，许多植株株高不到20厘米，大多数植株无雄穗产生，顶端也长出花丝，需要另取花粉为其授粉。
实施例2、实施例1中GUS基因的瞬时表达检测将共培养3天后的外植体，加入已配好的X-Gluc底物溶液中，37℃保温、过夜。肉眼或在体视镜观察外植体表面及内部。绿色组织需用FAA溶液固定1h以上，并依次用70％、90％、100％的乙醇脱色，然后观察统计其表达率，表达率如表6所示从表6的结果可以看出，各种基因型的幼胚与含超双元载体pTOK233、At5共培养3天后，都检测到了GUS基因的瞬时表达。GUS瞬时表达率从20％到68.7％，平均为52.3％。说明农杆菌能够侵染玉米，T-DNA已经进入到玉米细胞内。
表5、得到的抗性再生植株数品种质粒植株数Z3 pTOK233 32Z31 pTOK233 25Q31 pTOK233 23P9-10 pTOK233 11F pTOK233 26Z3 pAt5 22Z31 pAt5 25P9-10 pAt5 3F pAt5 11总计 178表6、农杆菌侵染玉米幼胚的GUS瞬时表达率品种 质粒 接种数 GUS+ 比率％Z3PTOK23310 4 40Z31 PTOK23340 13 42.5Z31 At510 2 20Q31 PTOK23350 28 56Q31 At520 15 75
P9-10PTOK233 32 22 68.7FpTOK233 10 6 60平均 172 90 52.3实施例3、实施例1中抗性愈伤组织的筛选经过高压培养的幼胚与含质粒At5的农杆菌共培养的幼胚放至含PPT5mg/L的筛选培养基上，开始筛选培养两周，然后转到含PPT10mg/L的筛选培养基上筛选培养，每三周继代一次。筛选培养至两个月，有一些愈伤生长状态良好，为抗性愈伤组织。统计产生的抗性愈伤率，如表7所示。
表7、农杆菌转化幼胚产生的抗性愈伤率品种 质粒接种数 抗性愈伤数比率(％)Z3 pTOK233 10824 22pAt5 11726 22Z31 pTOK233 17944 26pAt5 24844 18Q31 pTOK233 286126 44At5 15727 17P9-10pTOK233 18361 44pAt5 12137 31FpTOK233 10 440pAt5 61 33 54平均 1470 426 29两个月后，产生的抗性愈伤率达17％至54％。两种质粒转化幼胚产生的抗性愈伤率平均为29％。F产生的抗性愈伤率最高，且为II型愈伤。质粒pTOK233转化产生的抗性愈伤率平均为33.8％，质粒pAt5转化产生的抗性愈伤率平均为23.7％。
实施例4、农杆菌转化玉米幼胚再生植株的分子检测一、RO代的分子检测1、PCR检测提取RO代再生植株叶片DNA，随机选取质粒pTOK233所转的植株53株，用hpt基因的引物进行PCR扩增，有48株为PCR阳性，扩增出与质粒正对照同样大小的片段(480bp左右)，而未转化植株没有扩增出相应的片段。部分植株的PCR结果如图1所示，其中Mλ/HindIII+EcoRI marker；Ck+Plasmid pTOK233；CK-Untransformed，除泳道13以外，均扩增出了与质粒正对照同样大小的片段。
随机选取质粒At5所转的植株35株用bar基因的引物进行PCR扩增，有28株为PCR阳性，扩增出与质粒正对照同样大小的片段(460bp左右)，而未转化植株没有扩增出相应的片段。部分植株的PCR结果如图2所示，其中Lane M100bp Ladder；CK+Plasmid At5 CK-Untransformed control；Lane1-12transgenic plants；除泳道11以外，均扩增出了与质粒正对照同样大小的片段。
2、Southern检测提取RO代再生植株叶片DNA，经BamHI酶切后，用质粒MH酶切回收1.0kb的hpt基因片段为探针，对转pTOK233质粒的植株进行Southern blotting，部分植株得到了信号带，检测到了hpt基因，结果如图3所示，图中1-4泳道为转基因植株。
对转At5质粒的植株，经BamHI酶切后，用质粒pDM302酶切回收0.6kb的bar基因片段为探针，进行Southern blotting，部分植株得到了信号带，检测到了bar基因，结果如图4所示，图中泳道1-8是转基因植物，说明外源基因已经整合进玉米基因组中。
二、转化植株的后代检测1、转化植株后代的分子检测将转基因植株进行自交授粉，不能自交授粉的植株取与其相同基因型的其他转化植株或非转化植株的花粉授粉。取后代部分种子播种于温室，提取叶片总DNA进行PCR和Southern检测。转pTOK233质粒的植株后代，其中6个R1代株系检测到了PCR阳性的植株，其中5个R1代株系Southern blotting有阳性带。说明转基因能够稳定遗传到后代。编号为28转基因植株的R1代21株植株中14株Southern检测到hpt基因。
转At5质粒的植株后代的PCR发现，7个R1株系的植株检测到了PCR阳性的植株；2个R2株系，株系A2-1的10株PCR均为阳性，株系A5-1的17株中15株为PCR阳性。Southern blotting结果证实7个R1株系及2个R2代株系中均有阳性带植株。说明转基因已经稳定遗传到R1、R2代。
2、转化植株后代的抗性检测以为转基因的种子Z31做对照，取转hpt基因的植株的R1代种子20-2和28-6、28-5、28-12、28-13灭菌后，在含有潮霉素的培养基或培养液中筛选发芽，两周后，观察发芽情况，统计发芽粒数及根长，结果见表8。
表8、转基因后代的潮霉素抗性种子代号 平均根长(cm)总种子数 发芽种子数 比率％Z31(CK-) 1 284 14.320--21 2819 67.928--61 3030 10028--50.53030 10028--12 3 176 36.028--13 1 172 11.8未转基因种子(CK-)大部分发芽受到抑制，只有14.3％的种子发芽，发芽的种子的平均根长为1厘米。转基因植株的后代大部分发芽正常，但生长也受到影响，平均根长大多在1厘米以上。
3、转化植株后代的抗性检测转质粒At5的植株的R1代种子A6-4、A6-12和R2代种子A2-3、A2-5、A5-6抗除草剂PPT的发芽结果如表9所示表9、转基因后代的PPT抗性种子代号 平均根长(cm)总种子数发芽种子数比率％Z31(CK-) 3 27 13 48.1A2-3 10 29 27 93.1A2-5 8 29 25 86.3A5-6 9 27 26 96.3A6-4 8 25 25 100A6-12 5 27 22 81.5未转基因种子(CK-)大部分发芽受到抑制，只有48.1％的种子发芽，发芽种子的平均根长为3厘米。转基因植株的后代大部分生长正常，平均根长大多在9厘米左右。
实施例5、农杆菌转化玉米愈伤组织初生愈伤组织将幼胚盾片朝上，接种于愈伤培养基上，每培养皿中接种20-40个幼胚，28℃暗培养2-3周后，即可诱导出初生愈伤组织。
愈伤组织诱导出初生愈伤组织后，每2-3周继代一次，保留生长状态良好的愈伤组织。
按照实施例1的方法以愈伤组织为受体用带有外源基因的农杆菌对其进行转化，结果表明，初生愈伤组织作为转化受体，得到的抗性愈伤率为8％至46.4％，平均产生抗性愈伤率22.0％。
实施例6、基因枪辅助农杆菌转化玉米幼胚1、用70％乙醇将PDS-1000/He型基因枪的样品室及其部件，包括可裂膜、载体膜、阻挡网等喷洒或浸泡灭菌。
2、称取60mg金粉(直径1.0μm，Bio-Rad)，置于1.5ml离心管中，加入1ml无水乙醇浸泡一夜，振荡悬浮数次，离心收集金粉微粒沉淀。然后用无菌水冲洗3-4次，最后用1ml无菌水重新悬浮即成为微粒载体。
3、空微弹载体的制备取金粉悬浮液50ul，放入无菌的1.5ml离心管中，可供轰击5枪。
4、取制备好的微弹溶液迅速而均匀地涂于载体膜上，待水或乙醇挥发后将DNA面朝下装入载体固定架中，然后装上可裂膜，把在高渗培养基上处理4个小时的新剥离玉米幼胚放放入样品室内。
5、根据PDS-1000/He型基因枪操作指南，抽真空轰击。样品室真空度27mmHg，可裂膜压力1100psi，微弹飞行距离9cm，每皿轰击一次。
6、轰击后取出材料，封口，置于28℃培养室内。在高渗培养基上放置20小时后，再按照实施例1的方法与农杆菌共培养3天，然后放到筛选培养基上进行筛选培养，2个月后统计产生的抗性愈伤数，如表10所示表10、基因枪辅助农杆菌转化质粒品种 接种数抗性愈伤数比率(％)pTOK233 Z3 90 39 43.3pAt5Z31 90 34 37.7平均180 73 40从表10可以看出，幼胚经基因枪轰击造成伤口，再用农杆菌侵染，产生的抗性愈伤率平均达40％，转化率明显得到提高。抗性愈伤经分化，得到了再生植株。
实施例7、基因枪辅助农杆菌转化玉米愈伤组织1、玉米自交系Z3、Z31、Q31、P9-10的愈伤组织放在高渗培养基上处理4个小时备用。
2、用70％乙醇将PDS-1000/He型基因枪的样品室及其部件，包括可裂膜、载体膜、阻挡网等喷洒或浸泡灭菌。
3、称取60mg金粉(直径1.0μm，Bio-Rad)，置于1.5ml离心管中，加入1ml无水乙醇浸泡一夜，振荡悬浮数次，离心收集金粉微粒沉淀。然后用无菌水冲洗3-4次，最后用1ml无菌水重新悬浮即成为微粒载体。
4、微粒载体包被农杆菌取金粉悬浮液50μl，放入无菌的1.5ml离心管中，加入1mL农杆菌溶液，振荡器上振荡5分钟，4000转/分离心1分钟，去掉上清液，重复3次。微弹载体用16μl含100μM乙酰丁香酮的无菌水重悬，每次射击用4μl。
5、取制备好的微弹溶液迅速而均匀地涂于载体膜上，待水或乙醇挥发后将DNA面朝下装入载体固定架中，然后装上可裂膜，把第1步制备的样品放入样品室内。
6、根据PDS-1000/He型基因枪操作指南，抽真空轰击。样品室真空度27mmHg，可裂膜压力1100psi，微弹飞行距离9cm，每皿轰击一次。
7、轰击后取出材料，封口，置于28℃培养室内，在高渗培养基上放置20小时，转移到D-AS培养基上，视农杆菌的生长情况，以看不到农杆菌菌落为标准，尽量延长共培养时间。
8、共培养3-7天。洗涤去菌后转移到筛选培养基上进行筛选培养，统计产生的抗性愈伤数，如表11所示。
表11、基因枪辅助农杆菌转化产生抗性愈伤率质粒品种 接种数 抗性愈伤数 比率(％)pTOK233 Z3 110 9 8.2p3301 Q31110 17 15.5p3301 Z31110 13 11.8pAt5P9-10 60 711.7平均 390 46 11.8基因枪直接将农杆菌射入到植物愈伤组织中，产生抗性愈伤率平均为11.8％，比农杆菌转化幼胚的转化率低，但比基因枪直接射质粒的转化率高。


本发明公开了一种对玉米进行基因转化的方法，该方法包括以下步骤1)将玉米幼胚或愈伤组织浸入添加50－200μM乙酰丁香酮的携带外源基因的农杆菌D－inf溶液中，振荡30－60秒，并放置5－60分钟，取出吸干放到D－AS培养基上，在22－26℃黑暗条件下共培养2－7天；2)把幼胚或愈伤组织移入含有噻孢霉素的无菌水中洗涤并浸泡15－60分钟；3)取出幼胚或愈伤组织放至含噻孢霉素的愈伤诱导培养基上2－7天；4)低压选择培养；5)高压选择培养；6)诱导形成胚状体；7)将形成胚状体的再转入到分化培养基上进行分化，得到再生的转基因植物。