专利名称：一种三角帆蚌幼蚌dna活体取样方法三角帆蛘是中国特有的淡水育珠母蛘，选育出品质优良的三角帆蛘是当前需要解决的关键问题之一。利用分子生物学手段(如分子标记技术等)能有效对三角帆蛘进行遗传育种和种质改良。提取一定质量的高浓度基因组DNA是进行分子生物学研究的基础和前提，成体三角帆蛘活体提取DNA比较简便，但小规格三角帆蛘幼蛘活体提取DNA操作非常困难，目前均采用处死幼蛘，收集组织，进而提取DNA的方式，但这样会导致大量含有足够遗传信息的优良个体损失，所获得的个体遗传信息在选种上来说已经没有实际意义。因此，亟待建立一种提取三角帆蛘幼蛘活体DNA的方法。三角帆蛘繁殖存在一雌多雄受精的现象，在对亲本的遗传背景缺乏了解的情况下，可以利用幼蛘活体提取DNA技术鉴定幼蛘的遗传多态性及个体间的亲缘关系，进而选留优良个体单独培育，可以节省大量财力物力；利用幼蛘活体提取DNA技术可以进行目标经济性状的早期预选、基因筛选、养殖状况监测等多项研究工作。
本发明所要解决的技术问题在于，克服现有技术中的不足，提供一种获取三角帆蛘幼蛘活体微量组织提取DNA的方法。为了解决上述问题本发明的技术方案是这样的一种三角帆蛘幼蛘DNA活体取样方法，包括以下步骤1)幼蛘外套膜组织的剥离选取脱苗后50天的幼蛘20只，分成实验组和对照组，每组各10只，对幼蛘进行标记，并记录每只幼蛘的体长和体重；用刀片轻轻撬开实验组幼蛘蛘壳2 3mm，沿边缘划取外套膜组织，取样ang，用镊子夹取至离心管中；2)剥离组织基因组DNA的提取a.在上述离心管中加入200μ 1裂解液，55°C水浴消化至澄清，轻轻摇勻数次；b.之后加入200μ 1苯酚，轻微翻转混合IOmin后，12000r/min离心20min，用前端剪掉Icm的粗口枪头吸取上清液至新的离心管；c.重复步骤b，之后加入200 μ 1苯酚-氯仿-异丙醇混合液，其中苯酚、氯仿和异丙醇的体积比为25 24 1，轻微翻转混合10min，12000r/min离心20min，吸取上清液至新的离心管；d.之后加入200μ1氯仿-异丙醇混合液，其中氯仿和异丙醇的体积比为M 1， 轻微翻转混合lOmin，12000r/min离心20min，吸取上清液至新的离心管；e.之后加入两倍于离心管中溶液体积的无水乙醇，其中无水乙醇的温度为-20°C，然后于_20°C冰箱中静置至少30min，12000r/min离心20min，倒掉溶液；f.在离心管中加入70%乙醇200μ 1，洗涤两次，之后倒掉离心管中的液体，室温晾干；g.待酒精挥发完全后，加入80μ 1无菌水，4°C冰箱中溶解至少4小时；3)提取DNA的检测用0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段大小，DNA大分子条带清晰明亮；分光光度计检测DNA的浓度和纯度，DNA的浓度在42 130ng/ μ 1, DNA含量在3360ng以上，OD260/ OD280值在1. 8以上；4)幼蛘培育将取样后的幼蛘放入IL浓度为0. 01mg/L的金霉素消毒液中，浸泡30分钟后与对照组幼蛘均勻洒在底部铺有2cm细泥沙的培育池中，将富含浮游生物的水注入培育池中对幼蛘进行流水培育，并保持水流平稳以减少刺激，直至幼蛘达到稳定生长状态，一个月后， 对实验组和对照组幼蛘生长数据进行T检验和SNK检验，结果均显示实验组和对照组幼蛘的生长无显著差异。步骤1)中所述幼蛘的体长为1. 7 2. Icm,体重M3 391mg。步骤a中所述裂解液的成分如下Imol/L Tris-HCL10 μ 1,0. 5mol/L EDTA40 μ 1,10% SDS20 μ 1，10mg/ml ProteinaseK2 μ 1。所述lmol/L Tris-HCL 的 pH 为 8. 0。步骤2)中抽提DNA时均采用粗口枪头。有益效果如下1>现有技术中提取DNA的组织材料用量一般为20 50mg，本发明中用量为2mg 左右，用量极少；2>提取的DNA质量好，能满足生物学研究需求，且剥离微量组织对幼蛘的生长无影响；3>研究对象规格小，有利于科研工作提前开展，可以缩短研究周期；4>研究对象无需处死，有利于收集优良个体；5>早期选育目标经济性状，鉴定小规格幼蛘的遗传多态性及个体间的亲缘关系， 选留优良个体，提高育种效率。下面结合附图和来详细说明本发明；图1为本发明提取DNA的电泳图。
本实施例中三角帆蛘幼蛘DNA活体取样方法，包括以下步骤1>幼蛘外套膜组织的剥离选取脱苗后50天左右，体长为1. 7 2. Icm,体重为243 391mg的幼蛘20只，分为实验组和对照组，每组各10只，用油性记号笔对幼蛘一一对应标记，用游标卡尺测量记录体长，并测量记录体重；用宽度为5mm左右且有一定韧度的刀片轻轻撬开实验组幼蛘蛘壳2 3mm，沿着边缘划割外套膜组织2mg左右，将割离的外套膜组织划出，用镊子夹取至离心管中用于提取基因组DNA。2>采用酚氯仿法提取上述剥离组织的基因组DNA a.加入 200 μ 1 裂解液(lmol/L Tris_HCL，pH 8.0，10 μ 1 ；0. 5mol/L EDTA,40y 1 ； 10% SDS,20y 1 ；lOmg/ml Proteinase K，2 μ 1)，55°C水浴消化至澄清，轻轻摇勻数次；b.加入200 μ 1苯酚，轻微翻转混合lOmin，12000r/min离心20min，用前端剪掉 Icm左右的粗口枪头吸取上清液至新的离心管；C.重复步骤b，之后加入200 μ 1苯酚-氯仿-异丙醇(苯酚-氯仿-异丙醇的体积比为25 24 1)混合液，轻微翻转混合10min，12000r/min离心20min，吸取上清液至新的离心管；d.加入200 μ 1氯仿-异丙醇(氯仿-异丙醇的体积比为M 1)混合液，轻微翻转混合lOmin，12000r/min离心20min，吸取上清液至新的离心管；e.加入两倍于离心管中溶液体积的无水乙醇(_20°C )，_20°C冰箱中静置至少 30min, 12000r/min 离心 20min，倒掉溶液；f.用70 %乙醇洗涤两次，每次用200 μ 1，倒掉溶液，室温晾干；g.待酒精挥发完全后加入80 μ 1无菌水，4°C冰箱中溶解至少4小时；h.如图1，用0. 8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段大小，得到的DNA大分子条带清晰明亮；如表1，分光光度计检测DNA浓度和纯度，得到其浓度在42 130ng/y 1，DNA含量在3360ng以上，0D26Q/0D28Q值在1. 8以上，结果表明所提取的基因组DNA总量能满足亲子鉴定研究至少10对多态微卫星分子标记的需求。 表1分光光度计检测DNA结果


本发明公开了一种三角帆蚌幼蚌DNA活体取样方法，这种方法的研究对象规格小，研究对象无需处死，可早期选育目标经济性状，提高育种效率，且提取DNA的组织材料的用量极少，提取的DNA质量好，能满足生物学研究需求；其技术要点是这种三角帆蚌幼蚌DNA活体取样方法包括以下步骤1)幼蚌外套膜组织的剥离；2)剥离组织基因组DNA的提取；3)提取DNA的检测；4)幼蚌培育。