电场作用下用微孔阵列固液相捕获单分子模板dna的方法【技术领域】，具体涉及一种电场作用下用微孔阵列固液相捕获单分子模板DNA的方法。[0002]高通量测序技术是最近发展起来的DNA测序技术。相对于传统测序的96道毛细管测序，高通量测序一次实验可以读取几十万至几千万条序列。读取长度根据平台不同从25bp到500bp。不同的测序平台在一次实验中，可以读取IG到30G不等的碱基数据，这样庞大的测序能力是传统测序仪所不能比拟的。而实现高通量测序的核心是如何在一个系统内高效的捕获单分子模板，使之形成一个个独立分隔的微型反应器。[0003]目前的捕获技术主要有两种:液相-微珠或磁珠-乳液PCR( In-solution captureemulsion PCR)技术和生物芯片杂交(Chip-hybridization capture)技术，其具体方法包括:[0004](I)基于芯片的杂交捕获方法，该方法中基因组DNA首先被打断，然后与定制的序列捕获芯片杂交，没有杂交上的被洗掉。富集的目标群体随后被洗脱并扩增，然后用高通量测序仪测序。这种方法的几大优势:1、定向捕获基因组目标区(目前一块芯片最长可捕获5MB的指定基因组区域；2、数据可靠；3、只要你选择出想要捕获的区域就会设计并合成一块定制的序列捕获芯片，使用方便省力。但是此方法随机性很强，不能保证被捕获的不同DNA片段比例与原始溶液中一致，基因组DNA的需要量比较多，对于稀有的珍贵基因组不适用，其特异性不及in-solution方法。[0005](2)基于in-solution的杂交捕获方法的基本流程为基因组DNA打断，然后精选大小合适的文库与RNA诱饵共孵育24小时形成RNA-DNA杂合体，再洗脱磁珠后进行PCR扩增，最后进行测序。这种方法的几大优势:1)极佳的特异性:高达90%的读出序列来源于RNA"诱饵"捕获，其中和靶向序列完全重合的超过50% ;2)优秀的均一性:对基因组大片段序列，至少和捕获序列重合一半以上的RNA “诱饵”超过80%，即使对小片段的外显子序列，这一数字也超过60% ;3)卓越的重现性:2组技术重复试验间的差异率不到10-5 ；4)可以精确地检测SNP。综上所述，实验结果完美验证了基于液相序列捕获的高通量平行靶向测序技术的特异性、准确性、重现性和广泛的应用前景。但是因为所用的诱饵是RNA，所以需要很高的操作要求，试剂或者器具都需要用无RNA酶的。而且操作步骤比较繁杂。[0006]目前在新一代测序技术中，如第二代Roche的焦磷酸测序系统及ABI的SOLiD测序系统和第三代的1n Torrent,所使用的是in_Solution杂交捕获单分子,然后进行浮液PCR(emulsion PCR)进行克隆扩增。Illumina的Solexa测序系统所使用的是芯片杂交捕获。[0007]Roche的焦磷酸测序系统和Life Technologies的1n Torrent测序系统包括:I)先将基因组进行超声破碎打断成短的约50-500bp片段，然后将片段的两端连接通用接头Pl和P2。2)选择合适大小的微球共价结合上百万个引物Pl在其表面，in-solution用微球捕获一个模板DNA到一个小球，利用emulsion PCR扩增单一模板，将同一模板在一个微球上扩增成上百万个模板克隆。3)对携带有模板的微球进行富集。4)将携带有模板的微球加入到仪器的微孔阵列。这样微孔的利用率为50%左右，因为携带有模板的微球有两种一种是携带单一模板的微球；一种是非单一模板的微球，只有单一模板的微球符合测序要求。
[0008]ABI的SOLiD测序系统包括:1)首先进行基因组DNA的物理破碎，形成短的约50-200bp的DNA片段。2)将短的DNA片段两端连接通用接头A和B。3) In-solution用接有接头互补DNA的微球捕获，尽量做到一个微球捕获到一个单一模板DNA片段。4)将连有通用接头的模板在乳液体系里进行扩增(emulsion PCR),使同一模板在一个微球上扩增成上百万个模板克隆。5)微珠上的DNA分子模板的3’端进行修饰后，把微球通过3’端共价联结到玻片表面进行测序反应。
[0009]Illumi na的Solexa测序系统则是首先将基因组DNA进行片段化处理，回收片段DNA (100-200bp)进行通用接头连接。再将其处理成为单链状态，然后通过与芯片表面的单链引物碱基互补而被固定于芯片上，另一端随机的与附近的另一个引物进行互补，形成桥式结构进行桥式扩增(bridge amplification),利用这种方式,进行30个左右循环的扩增后，每个分子会放大1000倍以上，也变成单克隆DNA簇。在后续的测序反应中四种荧光标记的染料边合成边测序，每个循环中，荧光标记的dNTP是可逆终止子，只允许掺入单个碱基，主要就是因为3’羟基末端有可被识别的切割位置。在合成的过程中每个碱基的引入都会并行释放出焦磷酸盐，而且能够作为能量提供给生物的发光蛋白而发光。
[0010]上述测序方法成功的关键步骤就是捕获到单一的模板分子后，在水-油形成的浮液中进行PCR(emulsion PCR)达到单分子克隆扩增，使一个模板分子变成近百万个同等分子的分子簇。形成PCR的一个微小反应器目前采取的方法是使模板DNA稀释到一定浓度后增加一个微球捕获一个DNA单分子的比例，但这种方法最高只有30%的左右的微珠是含有单一模板克隆的微珠，有70%的微珠或者是没有模板结合或者是非单一的模板克隆。这一操作碰到的最大问题是如何保证一个微球或一个芯片上的位点只捕获到一个单一分子，和在溶液中如何保证每个微球之间都能分隔开形成一个个独立的微反应器。而现有的方法是随机操作，实验的成功带有一定的盲目性和与实验者的操作技能关系很大。而且乳液PCR本身的步骤就很繁琐，需要很高的操作要求。本发明因此而来。


[0011]本发明目的在于提供一种电场作用下用微孔阵列固液相捕获单分子模板的方法，解决了现有技术中单分子模板难以捕获，并形成PCR的一个微小反应器的难题。
[0012]为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是:
[0013]一种电场作用下用微孔阵列固液相捕获单分子模板DNA的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤:
[0014](I)构建具有微孔阵列的DNA电化学传感器，所述微孔阵列的微孔侧壁上的SiO2绝缘层通过羧基偶联固定Pl接头DNA片段；
[0015](2)在模板DNA的单链末端连接有与Pl接头DNA片段互补配对的Pl接头互补DNA片段，对模板DNA进行PCR扩增；[0016](3)通过电场作用使PCR扩增后的模板DNA进入微孔中与固定在微孔阵列的侧壁上Pl接头DNA片段进行互补配对连接，完成单分子模板DNA的捕获。
[0017]优选的，所述方法步骤(I)中Pl接头DNA片段具有SEQ No: 3的连续核苷酸序列；P1接头互补DNA片段具有SEQ No:4飞的连续核苷酸序列。
[0018]优选的，所述方法中模板DNA的单链另一末端还连接有用于PCR扩增模板DNA的P2接头DNA片段；所述P2接头DNA片段具有SEQ No:7~9的连续核苷酸序列。
[0019]优选的，所述方法中模板DNA的PCR扩增是在加入到DNA电化学传感器的微孔阵列流室内前进行；或者将模板DNA和PCR反应体系一同加入到具有Pl接头互补DNA片段的模板DNA先加入到DNA电化学传感器的微孔阵列流室内DNA电化学传感器的微孔阵列流室内进行PCR扩增。
[0020]优选的，所述方法步骤(3)中PCR反应体系包括PCR缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶、模板DNA和作为PCR扩增引物的P2接头DNA片段，所述PCR反应体系终浓度组成为:
[0021]PCR缓冲液终浓度I~IOX ；
[0022]dNTPs 0.01 ~1.5mM ；
[0023]引物序列终浓度为0.01~2 μ M ;
[0024]模板DNA 0.01 ~IOng/ μ L ；
[0025]TaqDNA 聚合酶 0.01 ~1.0U/ μ L。
[0026]优选的，所述方法步骤(2)模板DNA的制备方法包括以下步骤:
[0027]I)将用于制作模板DNA的目的基因组随机打断后采用第一引物进行第一次PCR扩增；所述第一引物一端连接有末端标记生物素的Pl接头互补DNA片段，并与目的基因区域序列互补结合的寡核苷酸单链序列；
[0028]2)使用捕获组分对进行第一次单向PCR扩增后的目的基因区域序列进行捕获；所述捕获组分包括亲和素和与亲和素结合的固相载体，所述亲和素与所述第一次单向PCR扩增后的目的基因区域序列上的生物素相结合；
[0029]3)使用第二引物对亲和素结合后的目的基因区域序列进行第二次单向PCR扩增；所述第二引物一端连接有Ρ2接头DNA片段，并与所述目的基因区域序列互补结合，且与第一引物进行PCR扩增的扩增方向相反；
[0030]4)将第二次单向PCR扩增后的目的基因区域序列除去亲和素生物素复合物，得到带有Pl接头互补DNA片段和Ρ2接头DNA片段的单链DNA文库作为模板DNA或形成双链的模板DNA。
[0031]优选的，所述方法中亲和素选自卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素。
[0032]优选的，所述方法中固相载体为磁性微球。
[0033]优选的，所述方法步骤(I)中所述DNA电化学传感器包括CMOS衬底，所述CMOS衬底上沉积有氮化硅层，所述氮化硅层上覆盖二氧化硅绝缘层；所述二氧化硅绝缘层为具有微孔结构的微孔阵列，所述微孔侧壁上SiO2`绝缘层通过羧基偶联固定Pl接头DNA片段。
[0034]优选的，所述方法SiO2绝缘层的微孔侧壁采用羧基化方法进行羧基化处理，然后使将氨基化的Pl接头DNA片段与SiO2绝缘层表面的羧基进行键合偶联固定；羧基化方法采用的试剂为丁二酸，羧基化方法的温度控制在75V ;偶联反应以1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)为羧基的活化试剂。[0035]Pl接头和P2接头
[0036]模板DNA中的Pl接头互补DNA片段是和微孔中的Pl接头DNA片段是互补配对的，习惯上统称为Pl接头，将Pl接头拆成两条单链后，一条固定在微孔内，一条与模板DNA结合，这样可以进行互补配对，从而实现了单分子模板DNA的捕获。作为例子，可以是以下的一种配对方式:
[0037]5’ -NH2-GAGGATCCAGAATTCTCGAGTT-3’ 为微孔中的 Pl 接头 DNA 片段(经氨基化处理后的Pl接头DNA片段)的连续核苷酸序列；而模板DNA的一条单链的连续核苷酸序列
为:3’ CTCCTAGGTCTTAAGAGCTCAA............GACTCGCCCGACCGTTCCG-5’(第一单链);另一条单
链的核苷酸序列为:
[0038]5，GAGGATCCAGAATTCTCGAGTT.............GCCTTGCCAGCCCGCTCAG-3 ’(第二单
链)。可以确定的是第一单链的Pl接头互补DNA片段(3’ -CTCCTAGGTCTTAAGAGCTCAA)与微孔中的Pl接头DNA片段互补。在模板DNA链中有一个单链是与微孔内种的接头DNA片段是互补的，因此要求模板DNA处理过程中需要制备特异的模板DNA的第一单链使其能够与微孔中的接头Pl接头DNA片段配对。
[0039]优选的，Pl接头DNA片段为选自以下的连续核苷酸序列:
[0040]