专利名称：重组毕赤酵母液体深层发酵生产β-1,3-1,4-葡聚糖酶方法随着我国工业的不断发展，葡聚糖酶在食品、酿造、纺织等行业中的需求量不断增长；由于葡聚糖酶对大麦、黑麦中的葡聚糖具有重要作用，故早期在国外主要应用于啤酒工业，并于七、八十年代在此领域广泛应用。我国啤酒工业发展迅猛；我国啤酒总产量已连续4年位居世界第一；在啤酒的生产上，美国、日本和丹麦等国均已采用β -葡聚糖酶作为啤酒工业的主要酶制剂之一；啤酒糖化时加入β-葡聚糖酶可分解麦芽中 β -葡聚糖凝胶，降低麦汁黏度，提高麦汁滤速及得率，有利于改善啤酒风味，保持成品酒的非生物稳定性；浙江江山啤酒厂试验认为，当使用溶解不良的麦芽时，添加β-葡聚糖酶， 麦汁过滤速度可加快33%，麦汁量增加1.8%，提高了原料的收得率和设备利用率，也提高了啤酒质量；在麦芽制造中，加入耐高温β-葡聚糖酶可显著降低成品麦芽中β-葡聚糖含量，使成品麦芽的β-葡聚糖含量达到合格范围，同时改善了麦芽中与β-葡聚糖相关的指标。葡聚糖酶作为饲用酶制剂的开发研究已成为生物技术在饲料工业中应用的重要领域；大麦是我国主要谷物之一，产量仅次于小麦、稻谷和玉米，位居第四；近年来，随着畜禽饲料生产的规模化、现代化，谷物饲料尤其是大麦饲料的用量不断增长，这一趋势使得葡聚糖酶的需求量也持续增加；国外以葡聚糖酶为主的复合酶制剂在大麦型饲料中的成功应用，为解决大麦等谷物饲料资源开辟了一条具有较高经济价值的重要途径； 目前，我国也已在饲料中推广应用含葡聚糖酶的复合酶制剂；在以大麦为主要能量的猪饲料中加入β-葡聚糖酶，其能量利用率可提高13%，蛋白质利用率提高21% ；余东游在《大麦型饲粮添加β-葡聚糖酶对猪生长性能的影响》一文中，对180头仔猪和中猪的饲养试验结果表明与对照组相比，饲粮中添加复合酶制剂使仔猪和中猪日增重分别提高了 20. 66%和11. 56%，料重比分别降低了 8. 87%和13. 61 % ；经济效益分析结果显示，加酶组仔猪和中猪的单位体增重饲料成本比不加酶组分别下降了 8. 44%和13. 26% ；同时减少了排泄物对环境的污染；在大麦日粮中添加β-葡聚糖酶加酶可以显著提高雏鸭血液中胰岛素生长因子水平；在产蛋鸡含50%饲粮中加入β-葡聚糖酶可替代常规玉米型饲料，产蛋性能有明显提高；在含大麦粉饲料中添加葡聚糖酶饲喂鲤鱼，结果表明，添加葡聚糖酶于含大麦(35%)的饲料中，能提高鲤鱼的增重率和降低饵料系数，提高饵料粗蛋白、粗脂肪和干物质的消化率。β -葡聚糖酶在制糖业中也有极其重要的应用；据文献报导，因葡聚糖形成而消耗蔗糖将导致大约每10，000吨甘蔗直接损失7吨蔗糖；由于葡聚糖的存在，导致制糖业提取率降低，最后糖蜜中残留蔗糖量增多，造成的损失是蔗糖转化成葡聚糖损失的3-5倍；有的糖厂防治葡聚糖的方法是添加杀菌剂，不但成本增加，且不符合绿色食品的要求；部分糖厂使用葡聚糖酶来处理煎汁中的葡聚糖，减少了糖分损失，取得了较好效果。此外，β -葡聚糖酶在植物有害真菌防治、水解酵母细胞壁、改性增溶方面的应用也有不少研究报道；葡聚糖酶还可用于牙膏中起到明显的洁齿作用，应用于洗涤剂中增强洗涤产品的去污能力，同时在食品、造纸、油井压裂等许多方面也被广泛应用。国外β -葡聚糖酶的大量研究工作始于20世纪60年代，截止到80年代已广泛应用于饲料和啤酒工业，一些酶制剂公司如丹麦Novo，荷兰Gist，美国Miles和芬兰Cultor 公司等纷纷推出自己的产品，这些酶制剂公司的商品酶制剂有的是单纯的β -葡聚糖酶制剂，有的则是混合型酶制剂(除β-葡聚糖酶外还含有α-淀粉酶、β-淀粉酶和蛋白酶等)；我国从20世纪80年代才开始葡聚糖酶的研究，迄今虽做了大量工作，但进口酶制剂垄断国内市场的局面仍未打破。
本发明是为了提供了一种重组毕赤酵母液体深层发酵生产β-1，3_1，4-葡聚糖酶的方法。本发明的技术方案如下一种β-葡聚糖酶的生产方法，利用毕赤酵母作为菌种，以酵母粉、蛋白胨、酵母氮源、生物素、甘油、H3P04、CaS04 · 2H20、K2S04、MgSO4 · 7H20、KOH为原料，进行液体深层次发酵生产β-葡聚糖酶，发酵滤液经板框过滤，得到滤渣及β-葡聚糖酶液；所得到的β-葡聚糖酶液在经过超滤和喷雾干燥得到粉状β-葡聚糖酶产品；所得滤渣可以作为饲料添加剂，不产生任何废弃物；具体包括下述步骤1、菌种制备及扩大培养1. 1将毕赤酵母试管斜面菌种在无菌条件下转入已制备好的装在3L三角瓶600mL 一级种子培养基中(pH6. 6 6. 8 ；灭菌条件115°C灭菌30min)，250rpm、30士 1°C培养12 14备用。1. 2用100L种子罐对菌种进行扩大培养将工业级的酵母粉480g，蛋白胨900g，lM磷酸缓冲液(pH = 6. 0) 6L，酵母氮源(无氨基酸)900g,生物素2%ig，甘油600g分别投入100L种子罐内，用自来水定容到60L ；搅拌均勻；然后用蒸汽直接灭菌，115度保温30分钟，再降温至30度，接入按步骤1. 1. 1所得的 600mL —级种子菌液；在风量0. 6 1、温度30士 1°C、罐压力0. 06 0. 08MPa的条件下培养30个小时，得扩大培养的毕赤酵母菌种备用。2、用1000L发酵罐发酵生产β -葡聚糖酶将工业级的甘油，30kg；H3P04,18L ；CaSO4 · 2H20，600g ；K2SO4,9. 6kg ；MgSO4 · 7H20， 7. 2kg ;K0H，1.8kg分别投入1000L种子罐内，用自来水定容到600L ；搅拌均勻；然后用蒸汽直接灭菌，115度保温30分钟，再降温至30度，灭菌后由观％ NH4OH调整pH到 5. 0，再添加 2. 61L 的微量元素(CuSO4 · 5H20，0. 6g/L ；ΚΙ,Ο. 08g/L ；MnSO4 · H20,0. 3g/L ； Na2MoO4 ·2Η20，0· 2g/L ；Biotin,0. 2g/L ；98%浓 H2SO4, 5mL/L)，接入 60L 一级种子培养液；在风量1 0.6 0.8、温度30 士 1°C、罐压力0.06v 0.08ΜΙ^的条件下培养，一段时间以后补甘油，到湿重长到200左右开始用甲醇诱导，诱导120小时，得到发酵液，利用板框过滤机将发酵液进行固液分离，得到滤渣和葡聚糖酶清液，所谓风量比是一立方米发酵液与每分钟所需要的进气量之比。3、将步骤2得到的β-1，3-1，4-葡聚糖酶清液采用分子量为1000道尔顿的超滤膜对粗酶液进行过滤和浓缩；然后采用离心式喷雾干燥塔进行喷雾干燥；进口温度140 150°C，出口 50 60°C，得到粉状β-1，3-1，4-葡聚糖酶包埋产品。4、葡聚糖酶活性测定采用DNS法，一个酶活力单位(U)定义为在50°C、pH 6. 0条件下，每分钟催化底物 (地衣多糖)水解产生1 μ mol葡萄糖的酶量。催化底物(地衣多糖)水解产生Imol葡萄糖的酶量；作为底物的地衣多糖是地衣Cetraria islandica(冰岛地衣)的糖原；它的结构与谷物β-葡聚糖相似；由于结构相对简单，地衣多糖经常作为测定β-1，3-1，4-葡聚糖酶活性的底物；这种由葡萄糖单元构成(主要是线性结构)的聚合物含有30%的β-1，3键和70%的β-1,4键。具体操作如下50°C预热的0. 5mL地衣多糖反应液中加入100 μ L粗酶液(上清液或稀释液)以及0. 4mL, 50°C水浴保温IOmin ；然后加入ImL DNS反应液和3mL水，立刻放入沸水中煮沸 5min以中止反应；取出后立即放入水中冷凝，在MOnm处以加底物和灭活酶液的管为参比溶液测定吸光度。酶活力的计算配置葡萄糖标准溶液，按照上述方法作出葡萄糖标准曲线，得出葡萄糖浓度与吸光度的关系。通过标准曲线查出的葡萄糖浓度，可计算酶活力(U mL—1)。r = (CGlc V F)/(ν t)r-反应速度[μ mol (mL. min) -1]，酶活性[U mL—1]CGlc-葡萄糖浓度[μ mol mL-1]V-测定体积(l.OmL)ν-样品体积和 70% 的 β -1，4 键(0. ImL)t-反应时间(IOmin)F-粗酶液稀释倍数(_) 附图是本发明的发酵培养附图。
本发明涉及一种重组毕赤酵母液体深层发酵生产β-1，3-1，4-葡聚糖酶方法，该方法利用重组毕赤酵母作为菌种，以酵母粉、蛋白胨、酵母氮源、生物素、甘油、H3PO4、CaSO4·2H2O、K2SO4、MgSO4·7H2O、KOH为原料，进行液体深层发酵生产β-葡聚糖酶，发酵滤液经板框过滤，过滤后得到滤渣及β-葡聚糖酶滤液；所得到的β-葡聚糖酶滤液在经过超滤和喷雾干燥后得到粉状β-葡聚糖酶产品；所得滤渣干燥后可以作为饲料添加剂，不产生任何废弃物，实现了β-1，3-1，4-葡聚糖酶的高产率发酵，使本发明可以适用于工业生产。