一种含碳纳米管的细胞支架及其制备方法【技术领域】，涉及一种含碳纳米管的细胞支架及其制备方法，具体为含碳纳米管的聚乳酸-羟基乙酸共聚物三维细胞支架及其制备方法。[0002]组织工程可以实现组织的再生。组织工程支架可以为因疾病、损伤、先天性缺陷等原因受到破坏的细胞提供生长所需的基础。该支架材料必须具备生物相容性、生物可降解性、高空隙性、力学适应性等性能。静电纺丝技术能够制备出与天然细胞外基质结构完全相同的三维多孔纤维，这种纤维膜可以作为理想的组织工程支架，便于目标细胞的粘附、增殖和迁移。[0003]随着静电纺丝技术的研究逐渐深入，目前有多种合成高分子和天然高分子原料用于静电纺丝技术制备纳米纤维[1]。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物降解性、细胞相容性和加工性，被广泛应用于组织工程材料[2]。高聚物PLGA已经通过美国FDA批准，可应用于替代人体原本组织的生物材料。利用静电纺丝技术制备的PLGA纤维支架，广泛应用于负载生物源细胞或人源细胞以重新构建组织工程化神经[3]、组织工程化骨骼M、组织工程化皮肤M等组织工程化组织的研究。但是目前的单纯PLGA支架材料存在缺陷，例如首先其构建的组织工程化组织往往存在力学性能单一不可控的缺点，而不能广泛应用于组织工程化骨，组织工程化皮肤，组织工程化肌肉等不同的人体组织替代物的硬度和强度需要，其次无法满足在构建组织工程化周围神经组织时，需要神经突触链接间的生物电流传导等电学性能要求，限制了单纯PLGA生物支架材料的应用范围。[0004]碳纳米管(CNTs)具有独特的结构，在工程材料的纳米增强、半导体材料催化剂载体等方面表现突出。此外，CNTs具有高拉伸模量、良好的导热与导电性能和独特的光电性质，使其在改善聚合物材料的力学、电学、热学、光学等方面拥有广泛的应用前景。随着制备技术的成熟与成本的不断降低，CNTs的应用研究越来越受到重视。[0005]同时兼顾两者的优点，从而得出更加适合组织工程使用的材料是很重要的，利用静电纺丝混纺技术就可以为提高已被FDA认证的PLGA材料的力学和生物学性能提供重要的途径。但进行不同材料的混制时，会对原有材料体系产生正负两个方向的影响，既要保留CNTS本身所具有的高比表面积的特点，又要克服其纳米毒性，如何选择反应原料和反应体系，在确定反应原料和体系的基础上，如何采用高粘度的PLGA对其进行包裹和修饰才能有效的减少这种纳米毒性对形成组织的影响等，都是本领域技术人员亟待解决的技术难题。
[0006]为了改善单纯PLGA生物支架材料的不足，本发明将CNTs与PLGA两种材料结合，通过静电纺丝技术制造适用于组织工程化组织与神经组织的细胞支架。首先，本发明介绍了一种简单方便的制备均匀CNTs悬浊液的方法，为后续生物支架的静电纺丝提供了保证。其次，本发明制备的含有CNTs的PLGA生物支架，兼具优良力学性能、导电性性能和生物性能。随着碳纳米管在混合材料中的含量变化，会使材料整体的不同性能产生出相应的变化，这主要表现为当CNTs含量较高时，发生的对于材料整体导电性的影响，而当CNTs含量较低时，产生的对于材料整体力学性能的影响。同时，CNTs本身所具有的高比表面积比，也使其单独使用有着具有争议的纳米毒性，采用高粘度的PLGA对其进行包裹和修饰可以有效的减少这种纳米毒性对形成组织的影响。本发明针对碳纳米管对材料力学性能的影响，得到一种生物支架的制备组分和方法，这种生物支架有望于有效地应用于骨骼、皮肤和神经等组织工程化组织的构建工作。
[0007]本发明以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)，六氟异丙醇(HFIP)，碳纳米管(CNTS)为原料，先将CNTs粉末制成均匀的悬浊液，再与同溶液体系下的PLGA母体纺丝液混匀后，投入静电纺丝。
[0008]一种含碳纳米管的细胞支架制备方法，其包括以下操作步骤:
[0009]a.将PLGA溶解在HFIP中制得PLGA溶液；
[0010]b.将CNTs加入HFIP中制得CNTs悬浊液；所述步骤a和b中的PLGA:CNTs:HFIP的比例范围为0.7g~2.1g:0.007~0.21g:7ml ;进一步优化的范围是0.7g~1.4g:0.07~
0.14g:7mlο
[0011]C.将PLGA溶液和CNTs悬浊液混合获得静电纺丝液后,进行静电纺丝。
[0012]在上述技术方案中，所述步骤a中的PLGA =HFIP的比例范围为0.7g~2.1g:2~5ml ;所述步骤b中的CNTs =HFIP的比例范围为0.007~0.21g:2~5ml ；
[0013]在上述技术方案中，所述含碳纳米管的细胞支架制备方法，其所述步骤a和b中的PLGA:CNTs =HFIP 的比例为 1.05g:0.014g:7ml。
[0014]在上述技术方案中，所述含碳纳米管的细胞支架制备方法，其所述步骤b中的CNTs悬浊液经超声处理至少Ih。
[0015]在上述技术方案中，所述含碳纳米管的细胞支架制备方法，其所述步骤a的PLGA溶液经水浴加热4~5h制备。
[0016]在上述技术方案中，所述含碳纳米管的细胞支架制备方法，其所述步骤c的PLGA溶液和CNTs悬浊液混合方式为室温下，磁力搅拌器上搅拌至少lh。
[0017]在上述技术方案中，所述含碳纳米管的细胞支架制备方法，其所述步骤c的静电纺丝为，在静电高压为15kv，接收板与喷头间的距离为10cm，静电纺丝液流速为lml/h的条件下进行。选择9号平头金属针。
[0018]在上述技术方案中，所述含碳纳米管的细胞支架制备方法，其特征在于，所述CNTs为碳纳米管，单分子长度10~20 μ m，且本种细胞支架制备方法适用于所有碳纳米管材料。单分子长度10-20 μ m为实施例采用，对于其他CNTS材料一样适用此种方法。
[0019]在上述技术方案中，所述含碳纳米管的细胞支架制备方法，其特征在于，所述PLGA为LA/GA=85/15，M=1 X IO5,且本种细胞支架制备方法适用于现存的所有PLGA高分子材料。
[0020]本发明的另一方面在于保护一种利用上述方法制备的含碳纳米管的细胞支架。
[0021]有益效果:
[0022]1利用本发明所述方法制备 的细胞支架，结合了 PLGA与CNTs两种材料的优点，改善了单纯PLGA生物支架材料的不足，兼具优良力学性能和生物性能等优点。在生物力学、亲水性、孔隙率、细胞粘附与生长等方面都具有很好的效果，实施例中选用力学拉伸实验、亲水性实验、扫描电镜和细胞实验数据分析都证明了利用所述方法制备生物支架的效果。
[0023]2本发明所述的CNTs预处理方法，将难溶解材料成功应用于静电纺丝技术中，同时介绍了一种CNTs生物支架的制备方法，这种生物支架有望于有效地应用于骨骼、皮肤和神经等组织工程化组织的构建工作。



[0024]本发明附图3幅:
[0025]图1是待测组样品PLGA15%(W/V)+CTNs0.2%(W/V)和对照组样品单纯成分PLGA15%(W/V)两种材料的扫描电镜(图ι-a和Ι-b)，直径分布(图1-C和Ι-d)，孔隙率(图ι-f，其中P指代PLGA15%单纯成分支架材料，C指代PLGA15%+CNTS0.2%混合成分材料)及亲水性(图Ι-e其中5s指代水滴接触材料5秒钟后，测量接触角，30s指代水滴接触材料30s后，测量接触角)的实验检测结果图。其中含CNTs0.2%的材料较原不含CNTs纯PLGA材料，总体表现为:PLGA15%+CNTs0.2%纤维直径均值为1734.02 土 20L 423nm，PLGA15%纤维直径均值为849.43 土 421.648nm。在单纯PLGA15%的纤维中增加CNTs成分后，导致材料整体纤维直径增加。原PLGA15%单成分纤维直径主要集中于600-800nm区间内，加入CNTs0.2%成分后，让纤维直径主要分布集中于1600-1800nm，直径分布集中区域提高了 I倍；亲水性CNTs的加入，5s时含CNTs成分材料亲水性较单纯成分PLGA15%材料亲水性有所提高，增加CNTs会让材料与水的接触角从120°降低至80°左右(图Ι-e左)；孔隙率，纯PLGA孔隙率为57%，PLGA15%+CNTS0.2%材料孔隙率为81%，增加CNTS会提高材料孔隙率(图l_f)。
[0026]图2是待测组样品PLGA15% (ff/V) +CTNs0.2% (W/V)和对照组样品单纯成分PLGA15% (W/V)两种材料的力学实验检测结果，图2-A =PLGA和图2_B:PLGA+CNTs为两种材料在拉伸破坏实验中表现出的应力应变曲线，图2-C为两种材料的通过力学拉伸试验得出的该材料的物理指标。从结果中可以看出，在材料中增加CNTs成分0.2%后的PLGA15%(W/V) +CTNs0.2% (ff/V)材料性能整体力学性能提高，总体表现为:含CNTs材料在杨氏模量，屈服强度，断裂应变3个物理指标中都明显高于纯PLGA材料，原PLGA15%材料杨氏模量为135.7MPa, PLGA15% (ff/V) +CTNs0.2% (ff/V)材料，杨氏模量为 191.88MPa,材料强度增高(图2-C，左)；屈服强度从2.07Pa升高至5.27Pa，材料变韧(图2-C，中)；而断裂应变由单纯PLGA15%材料的120%提高至212.6%，表明含CNTs可以整体提高纤维材料的力学强度和韧性(图2-C，右)。
[0027]图3是待测组样品PLGA15%(W/V)+CTNs0.2%(W/V)和对照组样品单纯成分PLGA15%(W/V)两种材料复合PC12细胞的生物实验结果，图3A-B为活细胞染色后共聚焦照片，图3C-D为细胞复合后，固定并扫描电镜照片。同时，图3A-C为含PLGA15% (ff/V) +CTNs0.2%(W/V)含量材料，图3B-D为纯PLGA材料 。通过观察照片，可以发现生长在含CNTs成分材料表面的PC12细胞，表现出更高的分裂数量和更亲和材料的特性，细胞在含CNTs材料表面可以在边缘伸出正常突起黏附与纤维(图3-A白色箭头)，同时也会允许纤维穿过胞体间隙直接参与细胞自身生长和固定(图3-C白色箭头)，含CNT电纺材料确实在和活体细胞复合中显现出优势。证明了增加CNTs对于材料整体的生物相容性有很大的作用。
[0028]下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0029]本发明所用原料主要有:
[0030]溶质:聚乳酸-羟基乙酸共聚物；碳纳米管(CNTs):单分子长度10~20 μ m ;是包括多壁和单壁碳纳米管材料的纳米材料。
[0031]溶剂体系:六氟异丙醇(HFIP)分析纯。
[0032]实施例1
[0033]一.制备待测组样品:PLGA15% (ff/V) +CTNs0.2% (ff/V)
[0034]静电纺丝液的准备阶段，即:采用溶解谱较广的HFIP作为承载不同高分子聚合物共同存在的溶剂体系，分别将PLGA和CNTs制备成六氟乙丙醇高分子溶液和悬浊液，再合并两者，磁力搅拌混匀得到成分均匀的纺丝液的过程。
[0035]1.首先将作为静电纺丝主体高分子聚合物主体的PLGA固体颗粒称取1.05g溶解在3mlHFIP (半体积总溶剂量)中，水浴(37°C )加热4~5h至完全溶解，制得PLGA溶液，即PLGA高分子纺丝液母体基质。
[0036]2.再将0.014g的CNTs加入4mlHFIP (半体积总溶剂量)中超声处理2小时，形成分散均一的CNTs悬浊液。磁力搅拌器搅拌Ih后液体外观呈现为碳纳米管粉末均匀分散在六氟异丙醇溶液中的悬浊液，超声Ih后液体外观呈现为均匀黑色悬浊液。
[0037]3.最后将上面步骤I和2中预处理好的、由HFIP承载的两成分液体(PLGA溶液和CNTs悬浊液)混合在一起制得PLGA15% (ff/V) +CTNs0.2% (W/V)，放于磁力搅拌器上，室温下磁力搅拌Ih后形成均一的含CNTs0.2wt%的PLGA纺丝液，外观呈现为均匀黑色粘稠液体。随着混合步骤进行，CNTs逐步均匀分散在整体纺丝前体液中。搅拌4小时使成分间充分分散均匀，获得静电纺丝液。
[0038]4.静电纺丝阶段:将步骤3处理好的静电纺丝液加入IOml注射器中，前端通过9号平头金属针头与静电纺丝机器连接，加在恒流入射泵上控制溶液流量。调节高压静电输出仪器控制电放过程中的加载在喷头与接收极间的静电高压为15kv。改变接收板与喷头间的距离确定接收距离为IOcm,调节溶液流速为lml/h。纺制2小时,纺丝结束后,将附着在接收铝箔上的材料连同铝箔放在通风橱中室温通风干燥过夜后取下，放在大培养皿中保存。制得本发明所述的含碳纳米管的细胞支架，即待测组样品:PLGA15% (ff/V) +CTNs0.2%(W/V)。
[0039]二.制备对照组样品:单纯成分PLGA15% (ff/V)
[0040]1.将作为静电纺丝主体高分子聚合物主体的PLGA固体颗粒称取1.05g溶解在7mlHFIP(半体积总溶剂量冲，水浴(37°C)加热4~5h至完全溶解，制得单纯成分PLGA15%(W/V)静电纺丝液。
[0041]2.按照实施例1的步骤4静电纺丝方法制备对照组样品材料单纯成分PLGA15%(W/V)。
[0042]实施例2表面形貌及直径分布
[0043]将待测组和对照组样品材料:PLGA15% (W/V)+CTNs0.2% (W/V)和单纯成分PLGA15%(W/V)分别裁剪出IcmX Icm的方形样品，喷金半小时,扫描电镜下检测微观形貌。喷金和照射扫描电镜后，每种材料选取3张1000X放大视野拍摄照片，要做到视野尽量能有代表性的体现所选材料的纤维微观分布。每张扫描电镜照片随机选6个视野，每个视野随机选5根纤维测量直径，总共每种浓度CNTs材料选取90根纤维，利用imagej软件对这些纤维进行直径测量分析。
[0044]结果和分析:上述实验数据证明CNTs的加入，使单纯PLGA材料纤维的直径增加。PLGA15%+CNTs0.2% 纤维直径均值为:1734.02 土 201.423nm, PLGA15% 纤维直径均值为:849.43 土 421.648nm。在单纯PLGA15%的纤维中增加CNTs成分后，导致材料整体纤维直径增加。原PLGA15%单成分纤维直径主要集中于600-800nm区间内，加入CNTs0.2%成分后，让纤维直径主要分布集中于1600-1800nm，直径分布集中区域提高了 I倍。这也证明了从宏观到微观范围内，CNTs参与进了整体纤维支架内，这种材料性质的改变，在其作为生物支架材料应用是，有利于提高材料总体的孔隙率，以及后续细胞生长后提供更适合的生长空间。
[0045]实施例3力学性能检测
[0046]通过INSTR0N5948力学拉伸检测仪的拉伸破坏实验得到材料的杨氏模量，屈服强度，断裂应变。所有材料样本在进行拉伸试验以前都经过了如下预处理:将待测组和对照组样品材料:PLGA15% (ff/V) +CTNs0.2% (ff/V)和单纯成分PLGA15% (ff/V)分别裁剪成为5cmX Icm的哑铃状结构,每份材料厚度用螺旋测微仪测量。两端各留出IcmX Icm正方形夹持位置，而工作面积为3cmX lcm,每种材料做5组平行实验。
[0047]拉伸破坏实验:将材料条两端夹在液压夹上，固定完毕后以10mm/min速率恒速轴向向两端牵拉材料至材料断裂。得出每种材料的应力一应变曲线，通过计算曲线得出该材料的杨氏模量(材料弹性形变时的曲线斜率)，屈服强度(即最大载荷/原始面积)，及断裂应变(材料最大应变)。
[0048]结果和分析:上述实验数据证明CNTs的加入，显著提高了单纯PLGA材料的力学性能。原PLGA15%材料杨氏模量为135.7MPa，加入CNTs0.2%成分后，材料整体杨氏模量提高至191.88MPa，使材料强度增 高。屈服强度从2.07Pa升高至5.27Pa，加入CNTs后，材料变韧。而断裂应变由单纯PLGA15%材料的120%提高至212.6%，综上所述，CNTs0.2%的加入使整体电纺纤维材料的力学性能得到非常大的增强，3个力学指标都有所提高。CNTs加入使的材料的力学强度增加，一方面可以使电纺材料进入更高强度的组织工程学领域，另一方面在对于材料强度的正调控中，也有重要作用。
[0049]实施例4亲水性检测
[0050]待测组和对照组样品材料:PLGA15% (ff/V) +CTNs0.2% (ff/V)和单纯成分PLGA15%(W/V)每组分别随机选取三张，在材料表面注射体积为0.2mlPBS水溶液，每个样品5个接触角。利用单反照相机照射水滴在材料表面的30s内的5s，30s两个时间节点的照片。计算接触角大小。
[0051]结果和分析:上述实验数据证明CNTs的加入，水滴接触材料时(5s)，含CNTs成分材料亲水性较单纯成分PLGA15%材料亲水性有所提高，增加CNTs会让材料与水的接触角从120°降低至80°左右。会对单纯PLGA材料表现出的强疏水表面(显然是不利于大多数活体细胞黏附和存活的微环境)有所纠正和改善。
[0052]实施例5孔隙率检测
[0053]待测组和对照组样品材料:PLGA15% (W/V)+CTNs0.2% (W/V)和单纯成分PLGA 15%(W/V)分别喷金和扫描电镜后，每种材料选取3个1000X放大视野拍摄照片，要做到视野尽量能有代表性的体现所选材料的纤维微观分布。根据文献中提出的方法，分别测出每张照片中Vtotal (即为3D纵深重构后的X，Y，Z轴坐标乘积)，Vsolid (材料扫描电镜2D积分值)，根据公式孔隙率θ=1- (Vsolid/Vtotal)得到每张SEM所示材料的孔隙率值，求出孔隙率平均值和误差。
[0054]结果和分析:由于CNTs加入，并负载到微观每一根纤维中，使复合后的电纺材料纤维直径分布增加，那么就使得整体材料的孔隙率增加，实验结果也给出验证，加入CNTs后使材料孔隙率增加，这样就是材料为细胞黏附和进一步生长提供了空间保证。
[0055]实施例6生物学性能检测
[0056]待测组和对照组样品材料:PLGA15% (ff/V) +CTNs0.2% (ff/V)和单纯成分PLGA15%(W/V)在生物学实验前，需要正反紫外灭菌各lh，用无菌线绑紧于去掉底面的冻存管口。在无菌PBS中盐平衡浸泡过夜，在基础NB培养基中浸泡过夜，方可用于提取的神经元种植体外三维培养实验。
[0057]将黏附3天的PC12的细胞与材料复合物从培养基中取出，I组进行活细胞荧光染色(calcein—h0echst33342)后在共聚焦纤维镜下观察细胞生长状态，另一组4%甲醛室温固定半小时后，喷金照射扫描电镜。
[0058]结果和分析:上述实验结果表明，含CNT电纺材料PLGA15% (ff/V) +CTNs0.2% (ff/V)确实在和活体细胞复合中显现出优势，表现为生长于其上的细胞黏附率增加，生物学行为正常，且有生长为组织工程化组织的趋势。PC12细胞复合在含CNTs的材料PLGA15% (ff/V) +CTNs0.2% (ff/V)上，有较好的黏附性，细胞能较好的黏附在材料上，基本可以铺满材料表面，扫描电镜照片可以显示细胞形态，而活细胞荧光结果可以显示PC12细胞在材料上的活性及生活状态。而生长在PLGA单成分纤维材料的PC12细胞不能全部保持其正常状态的梭形形态(图3-A白色箭头)，并没有出现在含CNTs材料PLGA15% (ff/V) +CTNs0.2% (ff/V)表面的PC12细胞那样包裹纤维(图3-C白色箭头)，并允许纤维穿过细胞外基质，而是更多的聚集在材料表面。这个现象突出表明了 CNTs改善纤维生物相容性的特征。
[0059] 参考文献
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