专利名称：人源化抗cdcp1抗体的制作方法人源化抗CDCP1抗体本发明涉及针对人⑶CPl的人源化抗体(抗⑶CPl抗体)、其生成方法、含有所述抗体的药物组合物、及其用途。人CDCPl ((含有 CUB 域的蛋白 1、B345、CD318、SIMA135、TRASK ；SEQ ID NO 29和具有突变R525Q(即SEQ ID NO 29的氨基酸位置525处用谷氨酰胺(Q)替换精氨酸㈨)和/或突变G709D(即SEQ ID NO :29的氨基酸位置709处用天冬氨酸⑶替换甘氨酸(G))的变体)是一种含有三个胞外CUB域的跨膜蛋白。发现此蛋白质在乳腺、结肠和肺癌中过表达。其表达水平与癌瘤细胞的转移能力相关联(Uekita，Τ.等， Am. J.Pathol. 172(2008) 1729-1739)。已经显示了它在癌细胞系中是酪氨酸磷酸化的(W0 2002/004508 ；Scherl-Mostageer, M.等，Oncogene 20(2001)4402-8 ；Hooper, J.，D.等， Oncogene 22 (2003) 1783-94 ；Perry, S.，E.等，FEBS Lett. 581 (2007) 1137-42 ；Brown, Τ.， A. J. Biol. Chem. 279 (2004) 14772-14783 ；Ota, Τ. Nat. Genet. 36 (2004) 40-45) 已经报告了编码独特同等型的可变剪接转录物变体。WO 2002/004508 提及 CDCPl 为肿瘤相关抗原 B345。WO 2004/074481 提及 CDCPl 为转移性肿瘤细胞中表达的糖蛋白抗原SIMA135。W02005/042102提及CDCPl为牵涉卵巢癌的蛋白质。WO 2007/005502涉及靶向⑶CPl的用于治疗疾病的方法和组合物。US 2004/0053343(及 Conze，T.等，Ann. N. Y. Acad. Sci. 996 (2003) 222-6 和 Buehring，H. J.等，Stem Cells 22(2004)334-43)涉及用于鉴定某些干细胞群的CDCPl抗体。发明概述本发明的一方面是一种特异性结合人⑶CPl的抗体，其包含CUB4抗体(保藏号 DSM ACC2551)的重链可变域(VH)SEQ ID NO 1 和轻链可变域(VL)SEQ ID NO :2，所述抗体的特征在于a)是人源化的，并b)在所述VH序列中包含替换苏氨酸⑴的第57位赖氨酸⑷、和替换脯氨酸⑵的第60位缬氨酸(V) (所有位置均依照Kabat编号)。本发明的另一方面是一种特异性结合人CDCPl的抗体，其包含CUB4抗体(保藏号 DSM ACC2551)的重链可变域(VH)SEQ ID NO 1 和轻链可变域(VL)SEQ ID NO :2，所述抗体的特征在于a)是人源化的，并b)在所述VL序列中包含替换缬氨酸(V)的第33位亮氨酸(L)、和第47位的色氨酸(W)(所有位置均依照 Kabat 编号)。本发明的另一方面是一种特异性结合人CDCPl的抗体，其包含CUB4抗体(保藏号 DSM ACC2551)的重链可变域(VH)SEQ ID NO 1 和轻链可变域(VL)SEQ ID NO :2，所述抗体的特征在于a)是人源化的，并b)在所述VH序列中包含替换苏氨酸⑴的第57位赖氨酸⑷、和替换脯氨酸⑵的第60位缬氨酸(V)；并在所述VL序列中包含替换缬氨酸(V)的第33位亮氨酸(L)、和第47位的色氨酸(W)(所有位置均依照 Kabat 编号)。优选地，依照本发明的人源化抗体的特征在于重链可变域(VH)是SEQ ID NO :3。优选地，依照本发明的人源化抗体的特征在于轻链可变域(VL)是SEQ ID NO 14、 SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、或 SEQ ID NO: 18。优选地，依照本发明的人源化抗体的特征在于重链可变域(VH)是SEQ ID NO :3，且轻链可变域(VL)是SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO 17,SEQ ID NO 18,SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :23、或SEQ IDNO 24。优选地，依照本发明的人源化抗体的特征在于重链可变域(VH)是SEQ ID NO :3，且轻链可变域(VL)是SEQID NO 14,SEQ ID NO 15,SEQ ID NO 16,SEQ ID N0:17、 或 SEQ ID NO :18ο优选地，依照本发明的人源化抗体的特征在于所述抗体是人IgGl亚类的。优选地，依照本发明的人源化抗体的特征在于所述抗体在Asn297处用糖链糖基化，其中所述糖链内的岩藻糖量是65 %或更低。本发明的又一个实施方案是包含依照本发明的人源化抗体的药物组合物。本发明的又一个实施方案是用于治疗癌症的所述药物组合物，其包含依照本发明的人源化抗体。本发明进一步包括用于治疗癌症的依照本发明的人源化抗体。本发明进一步包括依照本发明的抗体用于制备供治疗癌症用的药物的用途。本发明提供了编码依照本发明的人源化抗体的核酸。本发明进一步提供了含有依照本发明的核酸且能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸的表达载体和含有此类载体的用于重组生成依照本发明的抗体的宿主细胞。本发明进一步包括包含依照本发明的载体的原核或真核宿主细胞。本发明进一步包括一种用于生成依照本发明的重组人源化抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达依照本发明的核酸，并自所述细胞或细胞培养物上清液回收所述抗体。本发明进一步包括通过此类重组方法获得的抗体。本发明进一步提供了一种用于治疗患有癌症的患者的方法，包括对诊断为患有此类疾病(并且因此需要此类疗法)的患者施用有效量的依照本发明的抗体。优选地，在药物组合物中施用抗体。现在已经令人^C讶地发现，与源自现有技术中已知的人源化的其它人源化型式相比，依照本发明的⑶CPl抗体CUB4的特定人源化型式显示改善的⑶CPl结合特性。这是由于CDRH2中、和/或CDRLl中及轻链框架中的特定氨基酸变化。令人惊讶地，与嵌合的和小鼠的CUB4抗体相比，依照本发明的CDCPl抗体CUB4的特定人源化型式显示改善的体内肿瘤生长抑制。发明详述CUB4 抗体指来自 DE 10242146 (EP 1 396 501，US 7, 541, 030)的具有保藏号 DSM ACC2551 (DSMZ)的保藏抗体，其具有重链可变域(VH)SEQ ID NO 1和轻链可变域(VL) SEQ ID NO :2ο所述CUB4抗体特异性结合人CDCPl。(编号为DSM ACC2551 (DSMZ)的保藏由 Eberhard-Karls-University Tubingen, Univcrsitatsklinikum Tubingen, Geissweg 3 72076 Tubingen 做出)。如本文中所使用的，术语“是人源化的”意指一种基于具有VH SEQ ID N0:1和 VL SEQ ID N0:2的小鼠CUB4抗体的抗体，其中(在用人恒定区嵌合化后)通过将鼠⑶R 嫁接入人抗体的框架区中来使所述VH和VL人源化(参见例如Riechmarm，L.等，Nature 332(1988)323-327 ；及 Neuberger，Μ.，S.等，Nature 314(1985)268-270 ；Queen, C.等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033 ；美国专利 No. 5，530, 101 ；美国专利 No. 5，585，089 ；美国专利 No. 5，693，761 ；WO 90/07861 ；及美国专利 No. 5，225，539)。重链和轻链可变框架区可以自相同或不同人抗体序列衍生。人抗体序列可以是天然存在的人抗体的序歹IK 例如在 Lefranc，M. P.，Current Protocols in Immunology (2000)-附录1PA. IP. 1-A. IP. 37中列出人重链和轻链可变框架区，并且经由IMGT，即国际 ImMunoGeneTics 信息系统 ⑧(http://imgt.cines.fr)或经由 http://vbase. mrc-cpe. cam. ac. uk 可访问。另外，依照本发明的人源化抗体具有a) VH的CDRH2中的特定突变(突变T57K和P60V)，和/或b) VL的⑶RLl中的特定突变(突变V33L)和VL的框架区中的特定突变(第47位自人VL框架氨基酸回复突变成小鼠氨基酸W)。令人惊讶地，人源化CUB4抗体中的此类突变导致改善的结合特性(与没有此类修饰的人源化CUB4抗体相比)。此外，⑶R和/或框架中的此类修饰导致具有改善的体内肿瘤生长抑制的依照本发明的人源化抗体(与嵌合的和小鼠的亲本抗体相比)。本发明的一方面是一种特异性结合人⑶CPl的抗体，其包含CUB4抗体(保藏号 DSM ACC2551)的重链可变域(VH)SEQ ID NO 1 和轻链可变域(VL)SEQ ID NO :2，所述抗体的特征在于是人源化的，并在所述VH序列中包含替换苏氨酸⑴的第57位赖氨酸⑷(在CDRH2中)、和替换脯氨酸⑵的第60 位缬氨酸(V)(在⑶RH2中)(所有位置均依照Kabat编号)。这意味着SEQID NO :1包含 VH的CDRH2中的突变T57K和P60V。本发明的另一方面是一种特异性结合人CDCPl的抗体，其包含CUB4抗体(保藏号 DSM ACC2551)的重链可变域(VH)SEQ ID NO 1 和轻链可变域(VL)SEQ ID NO :2，所述抗体的特征在于是人源化的，并在所述VL序列中包含替换缬氨酸(V)的第33位亮氨酸(L)(在CDRLl中)、和第47位的色氨酸(W)(替换来自人VL框架区的氨基酸)(所有位置均依照Kabat编号)。这意味着SEQ ID NO :2包含⑶RLl中的突变V33L和框架区VL中第47位自人至小鼠氨基酸W的回复突变。本发明的另一方面是一种特异性结合人CDCPl的抗体，其包含CUB4抗体(保藏号 DSM ACC2551)的重链可变域(VH)SEQ ID NO 1 和轻链可变域(VL)SEQ ID NO :2，所述抗体的特征在于是人源化的，并在所述VH序列中包含替换苏氨酸⑴的第57位赖氨酸⑷(在CDRH2中)、和替换脯氨酸⑵的第60 位缬氨酸(V)(在CDRH2中)；并在所述VL序列中包含替换缬氨酸(V)的第33位亮氨酸(L)、和第47位的色氨酸(W)(所有位置均依照 Kabat编号)。这意味着SEQ ID NO 1包含VH的CDRH2中的突变T57K和P60V，且SEQ ID NO 2包含VL的⑶RLl中的突变V33L和VL框架区中第47位自人至小鼠氨基酸W的回复突变。本发明的另一方面是一种特异性结合人CDCPl的抗体，其包含CUB4抗体(保藏号 DSM ACC2551)的重链可变域(VH)SEQ ID NO 1 和轻链可变域(VL)SEQ ID NO :2，所述抗体的特征在于是人源化的，并在所述VL序列中包含替换缬氨酸(V)的第33位亮氨酸(L)(在CDRLl中)、和第47位的色氨酸(W)(替换来自人VL框架区的氨基酸)；并且进一步的特征在于在所述VL序列中(进一步)包含第21位的甲硫氨酸(M)(替换来自人VL框架区的氨基酸)(所有位置均依照Kabat 编号)。本发明的另一方面是一种特异性结合人CDCPl的抗体，其包含CUB4抗体(保藏号 DSM ACC2551)的重链可变域(VH)SEQ ID NO 1 和轻链可变域(VL)SEQ ID NO :2，所述抗体的特征在于是人源化的，并在所述VH序列中包含替换苏氨酸⑴的第57位赖氨酸⑷(在CDRH2中)、和替换脯氨酸⑵的第60 位缬氨酸(V)(在CDRH2中)；并在所述VL序列中包含替换缬氨酸(V)的第33位亮氨酸(L)和第47位的色氨酸(W)(替换来自人VL框架区的氨基酸)；并且进一步的特征在于在所述VL序列中(进一步)包含第21位的甲硫氨酸(M)(替换来自人VL框架区的氨基酸)(所有位置均依照Kabat 编号)。本发明的另一方面是一种特异性结合人CDCPl的抗体，其包含CUB4抗体(保藏号 DSM ACC2551)的重链可变域(VH)SEQ ID NO 1 和轻链可变域(VL)SEQ ID NO :2，所述抗体的特征在于是人源化的，并在所述VL序列中包含替换缬氨酸(V)的第33位亮氨酸(L)(在CDRLl中)、和第47位的色氨酸(W)(替换来自人VL框架区的氨基酸)；并且进一步的特征在于在所述VL序列中(进一步)包含第21位的甲硫氨酸(M)(替换来自人VL框架区的氨基酸)；替换丝氨酸⑶的第 24位甘氨酸(G)或精氨酸(R)(在CDRLl中)、和替换缬氨酸(V)的第25位丙氨酸㈧(在 ⑶RLl中)(所有位置均依照Kabat编号)。本发明的另一方面是一种特异性结合人CDCPl的抗体，其包含CUB4抗体(保藏号 DSM ACC2551)的重链可变域(VH)SEQ ID NO 1 和轻链可变域(VL)SEQ ID NO :2，所述抗体的特征在于是人源化的，并在所述VH序列中包含替换苏氨酸⑴的第57位赖氨酸⑷(在CDRH2中)、和替换脯氨酸⑵的第60 位缬氨酸(V)(在CDRH2中)；并在所述VL序列中包含替换缬氨酸(V)的第33位亮氨酸(L)和第47位的色氨酸(W)(替换来自人VL框架区的氨基酸)；并且进一步的特征在于在所述VL序列中(进一步)包含第21位的甲硫氨酸(M)(替换来自人VL框架区的氨基酸)；替换丝氨酸⑶的第 24位甘氨酸(G)或精氨酸(R)(在CDRLl中)、和替换缬氨酸(V)的第25位丙氨酸㈧(在 ⑶RLl中)(所有位置均依照Kabat编号)。本发明的另一方面是一种特异性结合人CDCPl的抗体，其包含CUB4抗体(保藏号 DSM ACC2551)的重链可变域(VH)SEQ ID NO 1 和轻链可变域(VL)SEQ ID NO :2，所述抗体的特征在于是人源化的，并在所述VL序列中包含替换缬氨酸(V)的第33位亮氨酸(L)(在CDRLl中)、和第47位的色氨酸(W)(替换来自人VL框架区的氨基酸)；并且进一步的特征在于在所述VL序列中(进一步)包含替换丝氨酸⑶的第M位精氨酸(R)(在⑶RLl中)、和替换缬氨酸(V)的第25 位丙氨酸(A)(在⑶RLl中)(所有位置均依照Kabat编号)。本发明的另一方面是一种特异性结合人CDCPl的抗体，其包含CUB4抗体(保藏号 DSM ACC2551)的重链可变域(VH)SEQ ID NO 1 和轻链可变域(VL)SEQ ID NO :2，所述抗体的特征在于是人源化的，并在所述VH序列中包含替换苏氨酸⑴的第57位赖氨酸⑷(在CDRH2中)、和替换脯氨酸⑵的第60 位缬氨酸(V)(在CDRH2中)；并在所述VL序列中包含替换缬氨酸(V)的第33位亮氨酸(L)和第47位的色氨酸(W)(替换来自人VL框架区的氨基酸)；并且进一步的特征在于在所述VL序列中(进一步)包含替换丝氨酸⑶的第M位精氨酸(R)(在⑶RLl中)、和替换缬氨酸(V)的第25 位丙氨酸(A)(在⑶RLl中)(所有位置均依照Kabat编号)。在本发明的一个实施方案中，依照本发明的人源化抗体的特征在于重链可变域(VH)是SEQ ID NO :3。在本发明的另一个实施方案中，依照本发明的人源化抗体的特征在于轻链可变域(VL)是SEQ ID NO 14,SEQ ID NO 15,SEQ ID NO 16,SEQ ID N0:17、或SEQ ID NO :18。在本发明的另一个实施方案中，依照本发明的人源化抗体的特征在于重链可变域(VH)是SEQ ID NO :3，且轻链可变域(VL)是SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO 17,SEQID NO 18,SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :23、或SEQ ID NO 24。在本发明的另一个实施方案中，依照本发明的人源化抗体的特征在于重链可变域(VH)是SEQ ID NO :3，且轻链可变域(VL)是SEQID NO 14,SEQ ID NO 15,SEQ ID NO 16,SEQ ID N0:17、 或 SEQID NO :18ο在本发明的另一个实施方案中，依照本发明的人源化抗体的特征在于重链可变域(VH)是SEQ ID NO :3，且轻链可变域(VL)是SEQ ID NO :14。在本发明的另一个实施方案中，依照本发明的人源化抗体的特征在于重链可变域(VH)是SEQ ID NO :3，且轻链可变域(VL)是SEQ ID NO :15。在本发明的另一个实施方案中，依照本发明的人源化抗体的特征在于重链可变域(VH)是SEQ ID NO :3，且轻链可变域(VL)是SEQ ID NO :16。在本发明的另一个实施方案中，依照本发明的人源化抗体的特征在于重链可变域(VH)是SEQ ID NO :3，且轻链可变域(VL)是SEQ ID NO :17。在本发明的另一个实施方案中，依照本发明的人源化抗体的特征在于重链可变域(VH)是SEQ ID NO :3，且轻链可变域(VL)是SEQ ID NO :18。在本发明的另一个实施方案中，依照本发明的人源化抗体的特征在于重链可变域(VH)是SEQ ID NO :3，且轻链可变域(VL)是SEQ ID NO :23。在本发明的另一个实施方案中，依照本发明的人源化抗体的特征在于所述抗体是人IgGl亚类的。在本发明的另一个实施方案中，依照本发明的人源化抗体的特征在于所述抗体在Asn297处用糖链糖基化，其中所述糖链内的岩藻糖量是65%或更低。依照本发明的人源化抗体的优选实施方案的特征在于人源化重链可变域VH和人源化轻链可变域VL的下列组合之一，如表1中所显示的(参见以下例号)。表1 人源化重链可变域VH和人源化轻链可变域VL的优选组合。
本发明涉及针对人CDCP1的人源化抗体(抗CDCP1抗体)、其生成方法、含有所述抗体的药物组合物、及其用途。