一种人源化抗人白细胞介素1 β单克隆抗体及其制备与应用的制作方法【技术领域】，特别涉及一种人源化抗人白细胞介素I 0单克隆抗体及其制备与应用。[0002]人白细胞介素I 0 (hIL-1 ^ )是一种由单核细胞和巨噬细胞等不同类型细胞分泌的促炎细胞因子，它主要通过激发如促肾上腺皮质激素、血小板因子_4、前列腺素E2、白细胞介素-6和白细胞介素-8等其他炎症调节因子来引发一系列的生物学效应。hIL-10可以通过激活任何类型细胞上的hIL-1受体激发局部或全身的炎症反应。[0003]hIL-1家族细胞因子与许多疾病相关(Dinarello CA，N Engl J Med(2009) 360:2467 - 70)，家族成员包括 hIL-1 a ,hIL-1 ^ 和 hIL-1Ra，其中以 hIL_l @ 为主，是一种在炎症反应中起关键作用的细胞因子。在中枢神经系统，hIL-1与发热、食欲不振、慢波睡眠有关；在脉管系统，hIL-1引起血管扩张，诱导粘附分子和趋化因子表达，促进中性粒细胞外渗；在肝脏中，hIL-1诱发急性时相蛋白合成；在结缔组织中，hIL-1可致骨吸收和胶原酶合成，促进成纤维细胞、角质细胞增殖和组织重建。另外，hIL-1能刺激造血系统、激活免疫系统，还能抗中性粒细胞凋亡，并在骨组织、上皮组织中发挥作用。[0004]hIL-1的上述活性是对感染或损伤作出的有益反应,但hIL-1的异常调控则对机体产生不利影响。病毒、细菌、真菌、寄生虫感染病人，痛风病人，Alzheimer病、自身免疫紊乱、血液透析、心肌梗塞、移植物抗宿主病人,创伤病人及实体肿瘤、白血病、动脉粥样硬化、低血压病人中，hIL-1表达量明显高于正常水平。hIL-1在类风湿性关节炎(特别是慢性风湿性关节炎)、非感染性肝炎、胰腺炎等炎症中也扮演关键角色。hIL-1还牵涉到 II型糖尿病中葡萄糖毒性的发病机理的炎症过程(Maedler等人，J Clin Invest (2002) 110:851-860)，并在胰岛P细胞凋亡途径中具有明显意义(Donath等人，J Mol med(2003) 81:455-470)。[0005]近年来，国际上对直接抑制hIL-1 ^的抑制剂作为治疗药物进行了大量研究，例如受体拮抗剂、DNA合成抑制剂、单克隆抗体等，被用于治疗如急性痛风、类风湿关节炎、II 型糖尿病和非感染性葡萄膜炎等相关疾病，其中，单克隆抗体的应用前景最为广阔，具有超过了其他潜在·治疗方法的优点。单克隆抗体的特点是:理化性状高度均一、生物活性单一、 与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制，并且来源容易。这些优点使它一问世就受到高度重视，并广泛应用于生物学和医学研究领域。然而，动物来源的单克隆抗体作为外源性的抗原，多次反复的注射后能促使机体发生免疫应答，产生相应的抗抗体，产生排斥现象，限制了单抗技术的应用和发展。[0006]目前避免或减少免疫反应的主要途径是将单克隆抗体人源化，研制人源化单克隆抗体。但目前这类抗体往往会遇到亲和力下降、活性不高、产量低等问题。因此，在本领域有必要研发新型的抗hIL-10的单克隆抗体药物，以期为相关疾病的治疗提供更广阔的空间。

[0007]本发明提供了一种新型的人源化抗人白细胞介素I P (hIL-10)单克隆抗体及其制备与应用。
[0008]本发明一方面提供了一种新型的人源化抗人白细胞介素I P (hIL-10)单克隆抗体，该抗体的轻链具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，重链具有SEQ ID NO: 2所示的氨
基酸序列。
[0009]本发明的hIL-1 ^单克隆抗体是通过将兔单克隆抗体进行人源化而得到的，对抗原具有很高的亲和力。本发明的hIL-10单克隆抗体在人宿主内的免疫原性大大低于所述兔源亲本抗体。
[0010]抗体的人源化方法是通过改变亲本抗体构架区的氨基酸序列，使人源化抗体的构架区与人抗体的构架区在序列上更为接近。与未经修饰的亲本抗体相比，人源化的抗体在宿主体内具有较弱的免疫原性，同时保留与抗原的高亲和力。具体方法可参考2003年8月 3日在中国国家知识产权局递交的申请号为03827110.9的美国专利申请案“兔单克隆抗体的人源化方法”中描述的方法。抗体的人源化方法可包括下列步骤:
I)兔单克隆抗体的获得
用hIL-1 3对兔子进行免疫处理，当兔子产生特异性免疫反应后，将免疫兔子的脾脏细胞与浆细胞瘤系融合在一起。融合之后，将细胞在含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT)的培养基中培养，选择用于杂交瘤生长，在经过2到3个星期后，开始出现杂交瘤细胞集落。对生长有杂交瘤细胞的培养液进行分析，检测是否产生针对抗原的单克隆抗体。可采用免疫沉淀法、放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)的体外结合分析法来测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。经过测定，选择能生产具有所要求的特异性、亲和性或活性抗体的杂交瘤细胞，可利用有限稀释法将克隆亚克隆化， 并按照标准程序进行培养。
[0011]2)序列比较。
[0012]根据美国专利申请案第03827110.9号中描述的方法，分离出编码单克隆抗体的 DNA并进行测序，确定兔免疫球蛋白重链和轻链的可变区序列。一旦确定兔亲本抗体VH和 VL的氨基酸序列后，一般采用适当的编号系统对氨基酸进行编号，例如Chothia与1998年和Kabat提出的编号系统，同时通常鉴定互补决定区和/或构架残基。然后，序列与人类免疫球蛋白序列数据库，一般是种系序列进行比较，从而鉴别类似的人抗体。这个类似的人抗体可称为“供体”抗体。
[0013]3)兔单克隆抗体的人源化
通过将亲本抗体的VH和VL区与供体抗体的VH和VL区进行排列对比后，改变亲本抗体构架区的氨基酸序列，使其与人抗体的构架区在序列上更为接近，从而得到本发明的人源化兔单克隆抗体。
[0014]DNA分子、载体、宿主细胞、制备方法
本发明还提供了编码目的抗体的DNA分子、载体、宿主细胞、以及制备目标抗体的方 法。[0015]本发明编码目的抗体轻链的DNA序列为SEQ ID NO: 3,编码分子抗体重链的DNA 序列为 SEQ ID NO:4。
[0016]在获得编码本发明的抗体的核酸序列后，可按照以下方法制备生产目的抗体。在许多实施例中，编码目标抗体的核酸是直接导入宿主细胞的，细胞在适当的条件下进行培养，从而诱导出被编码抗体的表达。任何适用于对表达盒进行表达的细胞都可以作为宿主细胞。例如，酵母、昆虫、植物等的细胞。在很多情况下，采用不会产生抗体的哺乳动物宿主细胞系，具体可以是:猴的肾脏细胞(COS细胞)；通过SV40 (COS-7, ATCC CRL 165 I)转化的猴的肾脏CVI细胞；人的胚肾细胞(HEK-293，Graham et al.J.Gen Virol.36:59 (1977));幼仓鼠的肾脏细胞(BHK，ATCC CCL 10);中国仓鼠的卵巢细胞(CHO，Urlaub and Chasin, Proc.Natl.Acad.Sc1.(USA) 77:4216，(1980));幼鼠的塞尔托利细胞(sertoli cells) (TM4, Mather, Biol.R印rod.23:243-251 (1980));猴肾脏细胞 (CVI ATCC CCL 70);非洲绿猴的肾脏细胞(VER0-76，ATCC CRL-1587);人的子宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2);犬类的肾脏细胞(MDCK，ATCC CCL 34);水牛鼠的肝脏细胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442);人的肺部细胞(W138，ATCC CCL 75);人的肝脏细胞(h印 G2, HB 8065);幼鼠的乳腺癌细胞;(MMT 060562，ATCC CCL 51) ；; TRI 细胞(Mather et al., Annals N.Y.Acad.Sci 383:44-68 (1982)) ;NIH/3T3 细胞(ATCC CRL-1658)和幼鼠的 L细胞(ATCC CCL-1) o其他细胞系在本学科领域的文献中也比较常见。从美国模式菌种收集中心(ATCC)可以获得多种细胞系，地址:American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va.20110-2209。 [0017]把核酸导入细胞的方法有许多种。比较常用的方法包括电穿孔 (electroporation)技术、粒子枪技术(particle gun technology)、憐酸钙沉淀(calcium phosphate precipitation)、直接显微注射等等。具体方法的选择一般取决于被转化的细胞类型，以及进行转化所处的具体环境(即:在试管、体外还是在有机体内进行)。有关这些方法的一般性介绍可以参考:Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed.，Wiley & Sons, 1995。在某些情况下,可以采用多阴离子转染脂质体 (Lipofectamine)和钙离子调节的细胞质基因转化技术。
[0018]在把试验核酸导入到细胞中之后，一般需要对细胞进行培养，正常培养温度为37 摄氏度，某些时候温度可以选择，培养时间为I到24个小时，从而充分地实现抗体表达。在大多数情况下，抗体大多分泌到细胞培养液的上清液中。
[0019]在哺乳动物的宿主细胞中，许多以病毒为基础的表达系统可以用来对一种抗体进行表达。在采用腺病毒作为表达载体的情况下，对相关抗体进行编码的序列可以捆绑在一个转录/编译控制复合体上，比如后期启动子(late promoter)和三重引导序列(leader sequence)。之后，可以采用试管内和活有机体内相结合的方法，把这个嵌合基因插入腺病毒基因组。如果插入病毒基因组中非重要的区域，重组病毒会成活并且能在被感染的宿主内表达抗体分子(Logan & Shenk, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 81:355-359 (1984))。如果加入适当的转录强化因子和转录终止子(terminator)等,可以提高表达的效率(Bittner et al., Methods in Enzymo1.153:51-544 (1987))。
[0020]对于长期进行重组抗体的高产量生产，可以采用稳定的表达形式。例如，可以通过生物工程技术稳定表达抗体分子的细胞系。如果不采用包含复制病毒原的表达载体，可以通过免疫球蛋白表达盒以及选择性的标记对宿主细胞进行转化。在导入外来的DNA之后， 细胞可以在富营养培养介质中生长一到两天，之后，把营养介质变成选择性培养液。重组质粒中的选择性标记对选择性培养液产生抵抗，使得细胞可以稳定地把质粒和染色体整合， 并融入细胞核之后，可以通过克隆并进一步生长为细胞系。这种经生物工程改造的细胞系尤其适用于对直接或间接与抗体分子相互作用的化合物进行筛选和评价。 [0021]一旦获得本发明所说的抗体分子，就可以采用本领域技术人员所知的常规方法对抗体分子进行纯化。具体纯化方法包括色谱法，比如，离子交换，亲和层析，尤其与蛋白质A的特定抗原进行亲和层析，以及凝胶排阻柱层析(size exclusion column chromatography)、离心过滤法、差异溶解度(differential solubility)等。在很多情况下，细胞分泌的抗体进入培养液，并在培养液中收获。
[0022]检测目标抗体的特性和活性
在获得本发明的抗体之后，可用常规手段对其进行鉴定。一般需要采用已有的方法对它的亲和力进行检验，这些检验方法包括:I)采用标记(用放射性同位素或荧光标记)母抗体、修饰后抗体以及母抗体识别抗原的竞争结合分析法(competitive binding analysis) ；2)用 BIACore 等仪器进行的表面等离子共振(surface plasmon resonance), 提供一个抗原的结合特性。采用这种方法时，把抗原固定在固相基因芯片上，并以实时方式测量抗体在液相状态下的结合力；以及3)流动细胞计数(flow cytometry),例如,采用突光激活的细胞筛选(FACS)分析法，分析抗体与细胞表面抗原的结合力；4)酶联免疫吸附分析(ELISA);5)均衡分离(equibrilium dialysis)或FACS。测量结合性亲和力一般采用 Harlow等人介绍的方法:《抗体:实验室手册(Antibodies: A Laboratory Manual))), First Edition (1988) Cold spring Harbor, N.Y.; Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995。
[0023]采用Fortebio Octet对本发明的人源化抗hIL-1 P单克隆抗体的结合亲和力进行测定，发现本发明的的抗体对hIL-1 ^具有很强的亲和力。
[0024]本发明的目标抗体同时具有很高的生物学活性。体外实验(如外周血免疫抑制实验)以及体内实验(如对猴实验性自身免疫葡萄膜视网膜炎的治疗试验等)均证明了本发明的抗体能很好的抑制hIL-1 ^的生物学活性。
[0025]药物纟目合物
本发明还提供了一种医药组合物，其包含本发明的抗体以及医药学上可接受的载体。 术语“医药上可接受的载体”指天然或合成的一种或多种有机或无机成分，本发明的抗体与其相混合有助于抗体发挥作用。可作为医药学上可接受的载体及其组分的物质包括糖类； 纤维素及其衍生物；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂；多元醇；海藻酸；乳化剂；润湿剂；着色剂；调味剂；压片剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；磷酸盐缓冲液等。
[0026]本发明的药物组合物可根据需要制成任何剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、 体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式可采用任何医药学可接受的给药方式。
[0027]应用
本发明的抗体可应用于制备治疗与hIL-10生物学活性相关的免疫疾病的药物或制剂。[0028]所述与hIL-1 ^生物学活性相关的免疫疾病包括急性痛风、类风湿关节炎、II型糖尿病、白塞氏葡萄膜炎等非感染性葡萄膜炎，等。
[0029]本发明的抗体能通过特异性结合IL-1P阻断IL-1受体激活从而治疗多种与 IL-1 P表达过量相关的疾病。国外具有相似IL-1受体拮抗功能的一个抗体药物和两个融合蛋白药物，目前已经获得美国食品药物监督管理局的批准，分别可用于冷吡啉相关的周期性综合征(CAPS)的治疗和类风湿性关节炎(RA)的治疗。此外有多篇文献报道(Helen J.Lachmann, et al.Arthritis & Rheumatism.2011:63(2):314-324; Cem Gabay, et al.Nature Reviews Rheumatology.2010:6:232-241)表明具有 IL-1 受体拮抗功能的制剂(如本发明的抗体)还可用于全身型幼年特发性关节炎(SJIA)的治疗、痛风、急性痛风(gout) (Schlesinger N，et al.Ann Rheum Dis.2011:70 (7): 1264-71.)、痛风发作预防、骨关节炎(osteoarthritis)的治疗、I/II 型糖尿病(T1DM&T2DM)的治疗(Claus M.Larsen, et al.The New England Journal of Medicine, 2007:356:1517-1526.)、非感染性葡萄膜炎的治疗(Gill A, et al.Annals of the rheumatic diseases 2012:71 (4): 563-566)、 慢性障碍性肺病-COPD的治疗、老年黄斑变性(AMD)的治疗、心血管疾病的治疗、以及粉刺 (Acne Vulgaris)的治疗。其中值得注意的是其可用于非感染性葡萄膜炎如白塞氏葡萄膜炎(Behpet’ s disease uveitis)的治疗应用。在我国，葡萄膜炎是常见的致盲眼病，患者约有300余万，一般为中青年。其中最常见的是非感染性葡萄膜炎，约占45-94.8%的比例， 致盲率约为23%，危害重大。Gill A等通过临床试验证明非感染性葡萄膜炎患者在接受抗 IL-1 P抗体给药后，患者病情得到明显缓解，急性葡萄膜炎恶化的时间间隔延长且严重性下降，表明抗IL-1 P抗体可用于非感染性葡萄膜炎的治疗。因此本发明的抗体预期在治疗非感染性葡萄膜炎或降低其严重性方面十分有潜力。[0030]试剂盒
如上所述，本发明还提供了用于实施本方法的试剂盒，试剂盒至少包括如下之一或更多:一种如前文所述的人源化的抗体hIL-10单克隆抗体，一种编码抗体的核酸，或包含抗体的核酸的细胞。试剂盒中还可以选用的组成包括:限制性内切酶(restriction enzyme)、控制引物(control primers)和质粒、缓冲液等。试剂盒的核酸可有酶切位点 (restrictions site)、多克隆位点区(multiple cloning site)、引物结合点(primer sites)等等，以便于实现与非兔抗体互补决定区编码核酸的结合。试剂盒的各构成部分既可以单独存在于分开的包装中，也可以根据需要，把某些兼容的成分预先置于一个包装内。
[0031]


图1 SDS-PAGE电泳图，泳道I为蛋白质分子量标准(Marker);泳道2为hIL_l ^单克隆抗体
图2是hIL-1 ^单克隆抗体经SEC-HPLC分析图谱图3是hIL-10单克隆抗体使用Fortebio Octet测定亲和力常数的图谱序列说明:
SEQ ID NO:1 hIL-10单克隆抗体的轻链氨基酸序列 SEQ ID NO:2 hIL-10单克隆抗体的重链氨基酸序列 SEQ ID NO: 3 hIL-10单克隆抗体的轻链的DNA序列 SEQ ID NO:4 hIL-10单克隆抗体的重链的DNA序列
[0032]下面将结合具体实施例进一步描述本发明。
[0033]本发明的人源化抗hIL-1 ^单克隆抗体在以下实施例中均简称hIL-10单克隆抗体。
[0034]实施例1 hiL-1 0单克隆抗体的制备
I)杂交瘤细胞的制备:用重组hIL-10 (rhIL-10 )对兔子进行免疫处理，当兔子产生特异性免疫反应后，按美国专利US7429487所述方法，将免疫兔子的脾脏细胞与兔永生化细胞240E-W2融合在一起。融合之后，将细胞在含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT)的培养基中培养，选择用于杂交瘤生长，在经过2到3个星期后，开始出现杂交瘤细胞集落。
[0035]2)杂交瘤细胞筛选:用酶联免疫吸附测定法(ELISA)对生长有杂交瘤细胞的培养液进行分析，检测是否产生针对抗原的单克隆抗体。以20 ug/ ml hIL-1 ^包被96孔板，加入待测的培养上清液，以培养液为阴性对照，相应的免疫兔血清为阳性对照。也即每个待测物对应3个检测孔。以有限稀释法作阳性细胞的单克隆化，结果筛选到432个阳性的杂交瘤细胞株。然后用Elisa法测定单抗对hIL-10与其受体(hIL-10R)结合的阻抗作用。具体测定方法有两种:a用hIL-1 PR包板后，加入InM hIL-1 ^和不同浓度的酶标人源化抗体(HRP标记)的混合溶液孵育2小时后，显色，测定490nm处的光吸收值。b用 hIL-1 PR包板后，加入InM hIL-10，37°C温育2小时后，分别加入不同浓度的酶标人源抗体(HRP标记)孵育2小时后，显色，测定490nm处的光吸收值。结果发现有60株能与hIL_l 3结合，从而影响hIL-1 0与1111-101?的结合。此外还用Fortebio Octet进行了亲和常数测定，用信号通路进行特异性测定等。经过一系列测定，最终选择能生产具有所要求的特异性、亲和性或活性抗体的杂交瘤细胞(本发明所选的克隆为Q26)，进行下一步实验。
[0036]3)抗hIL-1 ^单克隆抗体的人源化:抗体的人源化方法参考2003年8月3日在中国国家知识产权局递交的申请号为03827110.9的美国专利申请案“兔单克隆抗体的人源化方法”中描述的方法进行。利用此方法，改变亲本抗体构架区的氨基酸序列，获得本发明的人源化单克隆抗体(hIL-1 0单克隆抗体)。
[0037]4)人源化抗hIL-13单克隆抗体的制备
编码hIL-10单克隆抗体轻链和重链`的DNA序列分别由人工合成，并分别克隆至 PMD18-T 载体(Takara)中，利用 pOptiVEC ? -T0P0? 和 pOptiVEC ? -T0P0? (Invitrogen)分别构建重组表达载体并共转化CHO DG44细胞，筛选获得hIL-10单克隆抗体高表达细胞株，并进行无血清扩大培养以获得表达抗体(按OptiCHO? Antibody Express Kit操作说明书进行，Invitrogen)。
[0038]实施例2 hIL-10单克隆抗体的纯化 1.Mabselect (Protein A)亲和层析
1)溶液配制:
平衡缓冲液 A:20mM PB，0.15M NaCl，pH7.0 洗脱缓冲液B:20mM柠檬酸钠-Na2HPO4, pH3.2
2)纯化用平衡缓冲液进行平衡后，将样品上样于Protein A亲和层析柱，再次平衡后，用100% 洗脱缓冲液进行洗脱，并收集洗脱峰。
[0039]2 SP Fastflow阳离子交换层析
1)溶液配制
平衡缓冲液A:15mM PB, pH6.0 洗脱缓冲液B:20mM PB, pH7.2
2)纯化
将第一步纯化所得到洗脱峰用IM Tris-HCl pH9.0调pH至6.0，A液将填料平衡后上样，100% B洗脱，收集洗脱峰。
[0040]3 Q Fastflow阴离子交换层析
1)溶液配制
平衡缓冲液A:20mM PB, pH7.2 洗脱缓冲液 B:20mM PB，0.5M Na2SO4, pH7.2
2)纯化
填料用A液平衡后，阳离子交换层析收集的样品直接上样收集流穿，100% B冲洗柱子对填料进行清洗再生。
[0041]3)纯度鉴定
将经纯化后的样品进行SDS-PAGE不连续凝胶电泳系统分析(结果见图1)，以及SEC检测(结果见图2)。证明经过纯化，得到了纯度大于97%的样品。
[0042]样品经氨基酸测序、质量肽谱确认获得的抗体符合轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:1,重链的氨基酸序列为SEQ ID N0:2。
[0043]实施例3 hIL-10单克隆抗体的亲和力测定
利用Fortebio Octei^fhIL-1P单克隆抗体的结合亲和力进行测定。先将抗原 rhIL-1 ^生物素化后用Coarse G25在AKTA上脱盐，收集第一个峰约1.68ml，折算浓度约为0.15mg/ml。hIL-10单克隆抗体浓度1.8mg/ml，用PBS缓冲液稀释成40nM后，按2倍的比例依次稀释，使其浓度为20、10、5、2.5、1.25、0nM，按照Fortebio Octet QK使用规范进行亲和常数测定，共测定2次(参见附图3)。结果如表1所示，hIL-1 ^单克隆抗体的亲和常数在大约IOpM至大约25pM之间。
[0044]表1 hIL-1 P单克隆抗体的解离平衡常数(KD)