专利名称：抗人碱性成纤维细胞生长因子人源性scFv抗体及其应用的制作方法碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，又名成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2，FGF-2)，是成纤维细胞生长因子 (fibroblast growth factor, FGF)家族目前已知的23个成员中发现最早、研究最多的因子。bFGF有多种生物学作用，包括促生长、分裂、分化功能；对成纤维细胞具有强烈的促增殖作用。bFGF是一个多功能分子，分子表面具有多种结合表位，像受体结合位点，肝素结合位点，整合素结合位点等多个表位。针对不同表位的抗体具有不同的功能。而且，针对同一抗原的单克隆抗体具有非常大的多样性，可变区序列不同，也代表了单抗的亲和力的功能的差异。bFGF是继VEGF之后的最重要的刺激血管新生的细胞因子之一。与肿瘤的发生、发展关系密切，促进肿瘤的生长，有相当部分的肿瘤会出现bFGF和bFGF受体的高表达。bFGF 能促进肿瘤血管的新生，因而增加肿瘤的血液供应、为肿瘤生长提供氧和营养物质；促进多种生长因子的分泌，如VEGF，TGF，aFGF等，这些因子相互调节，共同促进肿瘤的发生。到目前为止，还没有见到国内外其他关于抗bFGF人源性单链抗体(ScFv)的报道。
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种抗人碱性成纤维细胞生长因子人源性scFv抗体。该抗体能特异性中和人bFGF(或FGF-幻的生物学活性。本发明的另一目的在于提供所述的抗人碱性成纤维细胞生长因子人源性scFv抗体的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种抗人碱性成纤维细胞生长因子人源性 scFv抗体，包括重链可变区和轻链可变区；所述的重链可变区的氨基酸序列如下所示QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSSYEMNff VRQACDRlP GKGLEffVSY I S S S G S T I Y YCDR2ADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARELTGDffGAFDIff GQGTMVTVSS；CDR33所述的轻链可变区的氨基酸序列如下所示QSVLTQPASVSGSPGQSITIS C TGTSSDVGGYNYVSff YQQCDRlHPGKAPKLMIY DVSNRPSG VCDR2SNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC SSYTSSSTVVCDR3F GG GTK L T V LG编码所述的重链可变区的基因序列如下所示CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA GCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGAAATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTC ATACATTAGTAGTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACG CCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGCTA ACTGGGGATTGGGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAGGGGACAATGGTCACTGTCTCCTCA ；编码所述的轻链可变区的基因序列如下所示CAGTCTGTGTTGACGCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACT GGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCAT GATTTATGATGTCAGTAATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCC TGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATACAAGCAGCAGCACTGTGGTA TTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGG ；编码所述的重链可变区的基因由360个碱基组成，编码120个氨基酸，可变区含有 3个⑶R(互补决定簇)区⑶Rl编码10个氨基酸，⑶R2编码8个氨基酸，⑶R3编码13个氨基酸；可变区的框架区与其他人源性抗体的同源性高达94%，而3个CDR区则是特异性序列，与其他人源性抗体Fd链有较大差异。编码所述的轻链可变区的基因由333个碱基组成，编码111个氨基酸，可变区含有 3个⑶R(互补决定簇)区⑶Rl编码14个氨基酸，⑶R2编码8个氨基酸，⑶R3编码10个氨基酸；可变区的框架区与其他人源性抗体的同源性为98%，而3个CDR区则为特异性序列，与其他人源性抗体λ链有较大差异。抗重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或成纤维细胞生长因子2(FGF_2)人源性scFv抗体蛋白的功能存在于抗体轻重链可变区抗原互补决定族(complementarity determing regions CDRs) CDR1、CDR2、CDR3 (是本发明的功能活性区)中特异性核苷酸序列决定的，其相应的氨基酸序列构成了抗体特异性bFGF或(FGF-2)抗原结合区。上述的抗重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或成纤维细胞生长因子2 (FGF-2) 人源性抗体的用途由于抗体的生物活性是由抗体轻链和重链可变区中的高变区(CDRs) 特异性的基因序列决定的，因此可采用基因工程方法，将编码所述的抗人碱性成纤维细胞生长因子人源性scFv抗体的基因构建、表达，得到多种形式的小分子基因工程抗体(如Fab 抗体、F (ab) 2、单链抗体(scFv)、纳米抗体(Nanobody)、抗体融合蛋白)和IgG全抗体。在原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞和真核细胞获得该抗体基因表达或以此基因为基础改建后的含有该抗体基因可变区的任何其他基因。获得具有中和人bFGF的抗体产物， 可在临床上进行如下应用(1)用于肿瘤的诊断，(2)抑制肿瘤血管新生和抑制肿瘤的生长和转移，(3)抑制肝、肺、肾纤维化的进程。上述的抗重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或成纤维细胞生长因子2 (FGF-2) 人源性scFv抗体在制备用于诊断和治疗肿瘤以及抑制内脏(如肾、肝或肺等)纤维化的抗体药物中的应用。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果本发明获得的抗bFGF或FGF-2 人源性scFv抗体，该抗体是全人源的，是从人噬菌体抗体库中筛选到的抗体，具有高亲和力和特异性，因为是全人源性的抗体，可以直接开发为人用的抗体药物。筛选到的人源性抗bFGF抗体具有特异性结合bFGF的特点，可有效中和肿瘤和纤维化患者体内过渡表达的 bFGF，能有效抑制肿瘤的生长和转移，还可用于抑制肝、肺或肾等纤维化的形成。
图1是不同scFv噬菌体抗体克隆的ELISA结果图。图2是scFv抗体克隆表达产物的SDS-PAGE和^festern blot检测结果图；泳道1为分子量标准；泳道2 4分别为三个不同克隆44，49，85的表达上清的 SDS-PAGE结果图；泳道5 7分别为对应的Western-blot结果图。图3是纯化后的单链抗体scFv44对bFGF诱导的人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs) 增殖的抑制试验结果图。图4是纯化后的单链抗体scFv44抑制人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)成管的抑制试验结果图。图5是纯化的单链抗体scFv44抑制神经胶质瘤细胞细胞增殖作用的结果图。

扩增ScFv 的上游引物 5，-GGATCCCAGGTGCAGCTGCAGGA-3，；下游引物5，-AAGCTTGCTGACCGTCCTAGGG-3，10XPCR Buffer (Mg2+) 5 μ 1, dNTP Mixture (2mM) 5 μ 1,上下游引物各 1μ l(10ymol/L)，Blendtaq-plus(Promega 公司)0. 5 μ 1，阳性噬菌体抗体克隆 1μ 1，灭菌去离子水补充至50 μ 1。PCR扩增程序为94°C预变性^iin，94°C变性45s，M°C退火40s，72°C延伸60s，沘个循环后，72°C延伸lOmin。反应产物经1. 2%琼脂糖凝胶电泳，胶回收并纯化，得到PCR扩增的kFv片段。酶切反应通过BamHI (Takara公司)和HindIII (Takara公司)双酶切pET3 i载体，通过酶切产物回收试剂盒回收载体；通过BamHI (Takara公司)和HindIII (Takara公司)双酶切PCR扩增的kFv片段，通过酶切产物回收试剂盒回收kFv片段。连接反应体系(10 μ 1) :pET32a酶切产物(50ng/ μ 1) 1 μ 1，ScFv酶切产物 5uL(50ng)，连接缓冲液2 μ 1，T4DNA连接酶(Promega公司)luL。加去离子水至终体积为 20μ L· 16°C连接过夜。连接产物转化大肠杆菌HB2151 (Promega公司)，挑取单克隆，提取质粒酶切鉴定，将阳性克隆送生工测序，重组载体命名为pET3h-ScFv重组载体。将测序正确的2号克隆接种2mL SB培养基(上海华壹生物科技有限公司)，37°C、200rmp的速度振荡培养8 9小时，接着将培养得到的Iml菌液接种至50ml含有50 μ g/mL Amp的SB培养基振荡培养至0D600 ^ 0. 8，加入IPTG至终浓度0. 5mmol/L, 30°C培养2 8小时，诱导表达之后将菌体离心，弃去上清，0. OlM, pH7. 2的PBS重悬菌体，超声破碎。12000g/min离心之后取上清，根据分子克隆操作，SDS-PAGE和Western-blot鉴定结果如图2所示，图2的结果表明，ScFv抗体在原核细胞中获得表达，并经Wfestern-blot鉴定正确。(2)kFv抗体的纯化①收集原核表达的菌液1L，5000rpm离心5min收集菌体沉淀，0. 01M、pH7. 2的PBS 洗涤两次，重悬于200mL PBS中。②设置MIS0NIX超声乳化仪的振幅为50，超声时间为5s，间隔时间为10s，总共超声时间为20min，超声温度上限为30°C，冰浴超声裂解菌体。③将裂解上清最大离心力离心30min，0. 45 μ m滤膜过滤，上清上样于含SOmM咪唑的PBS缓冲液(0. 01M、pH7. 2)平衡的Ni-NTA亲和层析柱，上样速度为0. 5mL/min、以含80mM 咪唑的PBS缓冲液(0. 01M、pH7. 2)洗涤至基线，再用含130mM咪唑的PBS缓冲液(0. 01M、 PH7. 2)洗涤杂蛋白峰，洗涤至A280值不再降低，洗涤速度为1. 5mL/min，最后用含500mM咪唑的PBS缓冲液(0. 01M、pH7. 2)缓冲液洗脱目的蛋白，纯化的kFv抗体的纯度达94%。实施例3(1)人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)增殖抑制试验用2 X IO3/孔的细胞胞密度接种HUVEC细胞(广州雅吉生物科技有限公司)到96 孔板中，用M199培养基(广州雅吉生物科技有限公司)添加10%胎牛血清(FBS，Gibico公司)于37°C培养16小时。将培养基换为含0.5%FBS的M199培养基，加入20ng/mL bFGF和不同浓度的实施例1制备得到的人源性&FV抗体，对照组同样换为含0. 5%牛血清(FBS) 的M199培养基，加入20ng/mL bFGF和与抗体等体积的0. 01M、pH7. 2的PBS)，37°C培养4天后，利用CCK-8试剂盒测定活细胞数量。结果见图3，图3的结果表明，抗bFGF kFv抗体能够有效抑制血管内皮细胞HUVEC的增殖，说明kFv能够中和培养体系中的bFGF的作用，进而抑制血管内皮细胞的增殖。(2) HUVECs的成管实验将基质胶(Metrigel)从_20°C取出，置冰上融化，将基质胶与置冰上预冷的M199 培养基按体积比1 1混勻。将稀释好的基质胶以50 μ L/孔加入到96孔孔板中。37°C孵育30min使基质胶凝固形成均一的胶层。用质量体积比为0. 25%的胰酶溶液消化HUVECs 细胞，用含体积百分比5% FBS的M199培养基重悬细胞调整细胞密度为IX IO5细胞/mL， 接着按150 μ L/孔的细胞到凝固的基质胶上，混勻细胞，37°C细胞培养箱孵育4小时。倒置显微镜下观察细胞成管情况，并计数成管数。结果见图4，图4的结果表明，抗bFGF kFv抗体组的血管内皮细胞成管数明显少于对照组，说明抗bFGF kFv抗体能够抑制血管内皮细胞的成管作用。实施例4肿瘤细胞增殖抑制试验将对数生长期的神经胶质瘤细胞U87MG(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司) 用DMEM培养基调整细胞密度为104/mL。在96孔板中，每孔加入1000个细胞，37°C培养过夜，使细胞贴壁。加入不同浓度的实施例2制备得到的人源性kFv抗体，对照组加入0.01M、 PH7. 2的PBS，37°C培养4天。4天后加入10 μ L CCK-8, 37°C孵育30min。酶标仪测定光吸收值0D405nm的读数。细胞增值抑制结果见图5，图5的结果表明，抗bFGF ScFv抗体能够抑制肿瘤细胞的增殖作用，其增殖抑制率达达到50%以上。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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本发明公开了一种抗重组碱性成纤维细胞生长因子人源性scFv抗体及其应用。该人源性scFv抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。编码重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示。编码轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示。该人源性scFv抗体具有高亲和力和特异性，由于是全人源性的抗体，可以直接开发为人用的抗体药物。将编码该人源性scFv抗体的基因构建、表达，得到多种形式的小分子基因工程抗体，如Fab抗体、F(ab)2、单链抗体、纳米抗体、抗体融合蛋白和IgG全抗体等，可用于制备诊断和治疗肿瘤和/或抑制内脏纤维化的抗体药物。