专利名称：人溶菌酶-人碱性成纤维细胞生长因子融合基因的设计及表达的制作方法人溶菌酶(Human lysozyme, hLY)是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β -1，4-糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。针对人溶菌酶的研究，对开发新的抗菌药物具有重要的眉、ο碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growthfactor, bFGF)是一种广泛存在于人体各种组织中的生物活性物质，具有强烈的血管生成作用。在体外，能刺激细胞增殖、迁移，诱导纤溶酶原激活物及胶原酶活性，是与肝素有高亲和力的细胞促分裂原。它被认为是血管生成刺激物、成纤维细胞增殖趋化因子、成肌细胞、角膜细胞、神经细胞生长的刺激物等，在体内参与多种组织的创伤修复过程，是体内重要的创伤愈合因子之一。随着抗生素的不断使用，细菌耐药性已成为现在医学的一大难题，也是医药领域研究的一个重要方向。因此，人们越来越重视对抗菌药物的研究，我们根据人溶菌酶与人碱性成纤维细胞生长因子的各自功能，同时考虑到两种蛋白的空间结构以及人体伤口处具有多种凝血酶，因而用凝血酶蛋白切割位点(LVPRGS)将两者融合，构建成新型的融合蛋白， 目的是使融合蛋白应用在人体伤口处时能自动裂解成同时具抗菌和皮肤修复功能的多肽。发明内容本发明的目的是提供人溶菌酶-人碱性成纤维细胞生长因子融合基因的克隆、工程菌的构建及其高效表达的方法。本发明的技术方案利用重叠PCR技术，将人溶菌酶基因与人碱性成纤维细胞生长因子进行融合，中间引入凝血酶切位点。将经测序正确的融合基因连接入质粒PPIC9K，转化毕赤酵母GS115，优化发酵条件，诱导表达重组融合蛋白。所述融合蛋白的核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2。所涉及到的pUCm-T-hly为本实验室构建和保藏，pMD19-T_hbfgf为中山大学郑有华博士所惠赠。所述的人溶菌酶-人碱性成纤维细胞生长因子融合基因的克隆方法利用重叠 PCR合成融合基因，重叠PCR涉及到的两对引物分别为(下划线部分为凝血酶切位点的核苷酸序列)
hLY-F :GAATTCAAGGTCTTTGAAAGGTGTGA，待融合的人溶菌酶基因片段的上游引物；
hLY-R CATAGAACCTCTTGGAACCAACACTCCACAACCTTGAACAT,待融合的人溶菌酶基因片段的下游引物；
hbFGF-Fl GTGTTGGTTCCAAGAGGTTCTATGGCAGCCGGGAGCAT,待融合的人碱件成纤维细胞生长因子基因片段的上游引物；
hbFGF-R GCGGCCGCTTAGCTCTTAGCAGACATTGGA,待融合的人碱性成纤维细胞生长因子基因片段的下游引物；
先分别PCR合成待融合基因的上下游片段，PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析并割胶回收目的条带。然后各取2uL上下游片段互为引物和模板进行嵌合酶基因的初步合成，最后加入hLY-F和WDFGF-R引物进行嵌合酶基因的大量扩增。将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与质粒PUCm-T连接(pUCm-T-hly-thr-hbfgf)，转化 JM109,经酶切鉴定正确后送上海生工测序。
将测序结果正确的pUCm-T-hly-thr-hbfgf与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒 pPIC9K-hly-thr-hbfgf(图1)，并对重组质粒进行序列测定。
所述的人溶菌酶-人碱性成纤维细胞生长因子融合基因工程菌构建的方法将经测序正确的重组质粒pPIC9K-hly-thr-hbfgf经Me I线性化后，转化毕赤酵母GS115，筛选得到高拷贝毕赤酵母重组子GS/hly-thr-hbfgf。
所述的人溶菌酶-人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白诱导表达方法将筛选得到的高拷贝毕赤酵母重组子GS/hly-thr-hbfgf在洸^…!！ 6. 5,2. 0%甲醇诱导108h，离心上清液为重组人溶菌酶-人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白粗发酵液，经截留分子量为 IOkDa的超滤膜浓缩，再经kphadex G_75凝胶过滤层析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组人溶菌酶基因-人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白分子量为33kDa。
本发明的有益效果本发明提供了一种人溶菌酶基因与人碱性成纤维细胞生长因子基因的融合、工程菌GS/hly-thr-hbfgf的构建及高效表达的方法。该融合蛋白的成功表达有较大的生物医药研究价值，也为融合蛋白药物研究奠定了基础。


图1 重组质粒pPIC9K-hly-thr_hbfgf的构建示意图
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1融合基因及其表达质粒的构建
采用重叠PCR技术构造融合基因hly-thr-hbfgf，主要分为四步以hLY_F 和 hLY-R 为引物进行第一轮 PCR(94 °C 4min ；30 个循环，94 °C 30s, 51 °C 30s, 72 °C 30s ； 72°C IOmin)合成待融合的人溶菌酶基因片段；以tibFGF-F和IibFGF-R为引物进行第二轮 PCR(940C 4min ；30 个循环，94°C 30s，51°C 30s, 72°C 30s ；72°C IOmin)合成待融合的人碱性成纤维细胞生长因子基因片段；将两轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带，分别纯化后混勻，在无引物的条件下进行第三轮PCR(94°C:3min ； 10个循环，94°C 30s，500C 30s, 720C 60s ；72°C IOmin)；以第三轮 PCR 反应液为模板，以 hLY_F 和 hbFGF-R 为引物进行第四轮 PCR(94°C 4min ；30 个循环，94°C 30s, 50°C 30s, 72 °C 60s ；72 °C IOmin)。将第四轮PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与质粒pUCm-Τ连接 (pUCm-T-hly-thr-hbfgf)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。将测序正确的 pUCm-T-hly-thr-hbfgf与质粒pPIC9K均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-hly-thr-hbfgf，并对重组表达质粒进行序列测定。
实施例2GS/hly-thr-hbfgf的构建、表达、产物纯化及活性测定
用Me I对pPIC9K-hly-thr_hbfgf进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS/hly-thr-hbfgf。通过发酵条件的优化，该融合蛋白在^TC、pH 6. 5、2%甲醇诱导10 得到大量表达，收集发酵液上清，按常规方法处理样品后，采用改良舒加法测得发酵液中人溶菌酶活性达40U/mL。发酵液经离心后的上清液为融合蛋白的粗发酵液，该发酵液经截留分子量为IOkDa的超滤膜浓缩，再经kphadex G-75凝胶过滤层析纯化，纯化后经SDS-PAGE电泳分析，在约33kDa处出现目的融合蛋白条市ο


本发明提出了一种人溶菌酶与人碱性成纤维细胞生长因子融合基因的构建方法，中间引入凝血酶切位点核苷酸序列，并公开了融合蛋白工程菌的构建和高效表达的方法。人溶菌酶与人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白高效表达的发酵条件是pH 6.5、2％甲醇添加量、26℃诱导108h。该发明具有较大的工业化生产潜力和药物研究价值。