专利名称：微生物发酵生产低温溶菌酶的方法溶菌酶(lysozyme，EC 3. 2. I. 17)又称细胞壁溶解酶，是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶。具有对人体无毒、无副作用等特点。溶菌酶作为生物酶制剂，已经广泛应用于饲料防腐、低温肉制品保鲜和医药领域等行业中，商品溶菌酶多由卵清中提取，但从卵清中提取的溶菌酶只对革兰氏阳性菌有抑制效果，对革兰氏阴性菌的抑制效果一般，限制了其使用(丁亦男，长春师范学院学报，2009)。故通过微生物生产对革兰氏阳性和革兰氏阴性都有抑制作用的溶菌酶，会产生良好的应用前景。虽然国内外对微生物发酵生产的溶菌酶的研究很多，但主要是研究中温溶菌酶，有关微生物发酵生产的低温溶菌酶的研究处于初级阶段，主要是菌种选育和产酶条件优化、生长特性、酶学性质、抑菌实验、以及低温溶菌酶毒性实验(郭沈波，青岛大医学院学报，2003 ;王美芝，中国海洋药物，2004 ;王跃军，海洋水产研究，2000 ;张锈，化学工程，2007);微生物发酵生产的低温溶菌酶产业化、规模化生产及应用还未见报道。微生物发酵生产的低温溶菌酶与高温、中温溶菌酶相比具有很大的应用优势，因为低温酶在低温下具有高酶活力及高催化效率，可大大缩短处理过程的时间并省却昂贵的加热或冷却费用；在节能方面有相当大的优势；经过温和的热处理即可使低温酶的活力丧失，而低温或适温处理不会影响产品的品质(孙谧等，海洋水产研究，2002)，这将有助于微生物发酵生产的低温溶菌酶的推广和使用。微生物代谢产物中分离的低温溶菌酶具有抗氧化、溶菌谱广的特点，对致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、多杀性沙门氏菌、枯草芽孢杆等都有较好的抑制作用(王美芝，中国海洋药物，2004 ;李义等，西北农业学报，2012)，能特异性地分解革兰阴性、阳性菌的细胞壁(张世英，青岛大学医学院学报，2004)。因此通过微生物发酵生产低温溶菌酶，在低温条件下可以保持较高的酶活，与中温溶菌酶相比具有更强杀菌、防腐、抗病毒等功效，增强了溶菌酶在医药，食品保鲜等领域的应用价值(冯学珍，食品工业科技，2008)。可以从根本上摆脱中温、高温酶的加热、冷却设备和工艺，降低投入成本。微生物发酵生产低温溶菌酶具有广阔的开发潜力和应用前景。
本发明的目的是提供一种微生物发酵生产低温溶菌酶的方法，该方法主要是微生 物经过低温驯化后，在10 16°C液体发酵生产低温溶菌酶的方法，这种生产方法获得的低温溶菌酶粗酶液活性可以达到154U/mg，如再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。当该酶活性为2200U/mg，其最小抑菌浓度可达0. 011% -0. 088% (g/ml)，即0.011%-0. 088% (g/ml)的溶菌酶可在10 16°C下能够完全抑制106CFU/ml的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌等多种菌株的生长。该酶制剂应用操作简单、方便、快捷、成本低。可以从根本上避免中温、高温酶的加热、冷却设备和工艺。本发明所述的一种微生物发酵生产低温溶菌酶的方法具体包括以下步骤(I)将产生溶菌酶的微生物逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低温环境中生长良好；(2)按常规方法将低温驯化后的溶菌酶产生菌在10 16°C逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3 9%接种量接入液体发酵培养基中，在10 16°C培养72 144h时，即微生物发酵生产低温溶菌酶结束； (4)将(3)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；(5)根据不同需要和使用对象不同，将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。溶菌酶产生菌(CGMCC编号4. 1145或4. 1076)，菌株先活化、定向驯化后，按本发明产酶条件发酵生产低温溶菌酶，产酶低温驯化后的菌株在4°C环境中可保存2个月，用10 25%甘油制成的菌悬液、在零下80°C条件下可以长期保藏。1.0L, pH 值 7. 2 7. 4，121°C 高压蒸汽灭菌 30min。②菌种低温驯化培养基蛋白胨5.0 15. 0g，牛肉膏2.0 4. 0g，NaCl 3. 0 7.Og,琼脂20g,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。③液体种子培养基葡萄糖7. 0 13. Og,蛋白胨3. 0 8. 0g, MgS043. 0 8. Og,CaCl2 1.0 3.0g，自来水1.01，？11值自然，1211高压蒸汽灭菌30111111。④发酵产酶培养基蛋白胨12. 0 17. 0g，牛肉膏7. 0 13. 0g，NaCl 3.0 7. 0g，自来水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生溶菌酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将⑵活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低温环境中生长良好；(4)按常规方法将低温驯化后的溶菌酶产生菌在10 16°C培养48 72h而后按5%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积3 5%的接种量接入10L的产酶培养基中，在10 12°C培养120 144h时，即微生物发酵生产低温溶菌酶结束；(6)将 (5)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温溶菌酶制剂。实施例二 (I)培养基制备①菌种活化培养基蛋白胨15. 0g，牛肉膏10. 0g,NaCl 5. 0g，，琼脂15. 0g，蒸馏水I. 0L, pH 值 7. 2 7. 4，121°C 高压蒸汽灭菌 30min。②菌种低温驯化培养基蛋白胨5.0 15. 0g，牛肉膏2.0 4. 0g，NaCl 3. 0 7.Og,琼脂20g,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。③液体种子培养基葡萄糖7. 0 13. Og,蛋白胨3. 0 8. 0g,MgSO4 3. 0 8. Og,CaCl2 1.0 3.0g，自来水1.01，？11值自然，1211高压蒸汽灭菌30111111。④发酵产酶培养基蛋白胨12. 0 17. 0g，牛肉膏7. 0 13. 0g，NaCl 3.0 7. 0g，自来水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生溶菌酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将⑵活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低温环境中生长良好；(4)按常规方法将低温驯化后的溶菌酶产生菌在10 16°C培养48 72h而后按5%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积5 7%的接种量接入50L的产酶培养基中，在12 14°C培养96 120h时，即微生物发酵生产低温溶菌酶结束；(6)将(5)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温溶菌酶制剂。实施例三(I)培养基制备①菌种活化培养基蛋白胨15. 0g，牛肉膏10. 0g,NaCl 5. 0g，，琼脂15. 0g，蒸馏水
I.0L, pH 值 7. 2 7. 4，121°C 高压蒸汽灭菌 30min。②菌种低温驯化培养基蛋白胨5.0 15. 0g，牛肉膏2.0 4. 0g，NaCl 3. 0
7.Og,琼脂20g,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。③液体种子培养基葡萄糖7. 0 13. Og,蛋白胨3. 0 8. 0g,MgSO4 3. 0 8. Og,CaCl2 1.0 3.0g，自来水1.01，？11值自然，1211高压蒸汽灭菌30111111。④发酵产酶培养基蛋白胨12.0 17. 0g，牛肉膏7.0 13. 0g，NaCl 3.0 7. 0g，自来水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生溶菌酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；
(3)将⑵活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低温环境中生长良好；(4)按常规方法将低温驯化后的溶菌酶产生菌在10 16°C培养48 72h而后按5%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积7 9%的接种量接入100L的产酶培养基中，在14 16°C培养72 96h时，即微生物发酵生产低温溶菌酶结束；(6)将(5)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；
(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温溶菌酶制剂。


本发明所述的一种微生物发酵生产低温溶菌酶的方法是将产生溶菌酶的微生物逐级低温驯化，使其在低温环境中生长良好；将低温驯化后的溶菌酶产生菌在10～16℃逐级扩大培养，按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在10～16℃培养72～144h时，即微生物发酵生产低温溶菌酶结束；发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集的液体即为粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，可以将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。