专利名称:一族新的灵长类造血生长因子的制作方法本发明涉及一族新的灵长类IL-3样造血生长因子，以及用遗传工程重组技术生产这种造血因子的方法。红细胞生成素，即造血生长因子，是促进造血细胞生存，生长和分化的蛋白。集落刺激因子(CSFS)是这些造血生长因子的子集，其特征在于能够维持造血细胞集落在体外生长，这些造血细胞起源于骨髓，胎儿肝脏，和其它造血器官的祖先细胞。某些红细胞生成素的生物化学和生物学鉴定和特性描述受到少量天然存在因素的阻碍，这些因素的来源如血液和尿。最近已经分子克隆了某些这种红细胞生成素，进行异种表达并纯化为均一性。[D.Metcalf，“The Molecular Biology and Functions of the Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factors”，Blood，67(2)257-267(1986).]其中红细胞生成素是人和鼠的GM-CSF，人的G-CSF，人的CSF-1和鼠的IL-3。已经证明人的GM-CSF[R，Donahue et.al.，Nature，321872-875(1986)]，鼠的IL-3[J.Kindler et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，831001-1005(1986);Metcalfetal.，Blood，6846-57(1986)]和人的G-CSF[K.Welteet al.，J.Exp.Med.，165941-948(1987)]在体内对红细胞生成有效。在此之前已经发现鼠蛋白IL-3在人的系统中没有复制。[D.R.Cohen et al.，Nucl.Acids Res.，143641(1986).]。本发明提供一族基本上没有其它灵长类蛋白的灵长类IL-3样生长因子，其特征是肽序列相同于或基本相似于下面表Ⅰ和Ⅱ中所示的氨基酸序列。这些序列可用表中所示的DNA序列或能够与多肽杂交和编码具有IL-3样生物学特性的多肽的序列或其它各种各样可证实这种特性的修饰序列所编码。这些多肽也以IL-3样生物学特性为特征。作为一个实例，本发明提供一种基本上不与其它人的多肽结合的人的多肽，其特征为肽序列与表Ⅱ所示的序列相同或基本相同并至少具有一种IL-3样生物学特性。作为本发明多肽的另一实例的是基本上不与其它灵长类多肽结合的长臂猿多肽，其特征为肽序列与表Ⅰ所示的序列相同或基本相同并至少具有一种IL-3样生物学特性。本发明多肽的特征在于至少具有一种IL-3样特性，这些特性如下a.用还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测得表观分子量约为14～35千道尔顿;b.在标准人骨髓测定中能够以10-100微微克分子的浓度刺激各种谱系的多种类型造血细胞集落的形成;c.在CML测定中能够以10-100微微克分子的浓度刺激CML细胞增殖;d.等电点为pH6.0～pH7.6;e.在Superose 6凝胶过滤柱上43kd处有一个单一的尖峰;
f.在N-聚糖酶处理之后的凝胶上有一个单一的20.5kd的条带;和g.对用Edman降解法分析N-末端的污染水平不大于2%。
另外，本发明提供含有有效治疗剂量的一种或多种本发明的多肽的药用组合物。这些组合物可用于治疗许多疾病的方法，这些疾病的特点是缺乏造血细胞。按照本发明的这些方法需要给病人服用有效量的至少一种在此所述的多肽。
这样的治疗方法可用于治疗下列疾病，如白细胞减少，血小板减少，贫血，B细胞缺乏，T细胞缺乏，细菌感染和病毒感染，包括在骨髓移殖之后免疫细胞或造血细胞缺乏。本发明的这些方法还可包括与IL-3样多肽同时或相继服用有效量的至少一种其它的红细胞生成素，白细胞介素，或生长因子。作为这种应用的典型的红细胞生成素包括GM-CSF，G-CSF，CSF-1或促红细胞生成素。典型的白细胞介素是IL-1，IL-2，IL-4或IL-6。这些方法也可使用生长因子(如B细胞生长因子)，B细胞分化因子，或嗜曙红细胞分化因子。
本发明的再一方面是可在表达基础上编码具有至少一种IL-3样生物学特性的灵长类多肽的DNA序列。这样的序列包括表Ⅰ或Ⅱ中所示的在5′-3′方向上的核苷酸序列。此外本发明还包括在严格条件下可与表Ⅰ或Ⅱ的DNA序列杂交的DNA序列或者在非严格条件下可与所述DNA序列杂交的DNA序列，该序列可在表达基础上编码具有至少一种IL-3样生物学特性的蛋白。表Ⅰ和Ⅱ序列的等位基因变异，无论这样的核苷酸变化是否引起肽序列的变化，连同它的其它类似物和衍生物也都包括在本发明中。
本发明的另一方面是含有如上所述DNA序列的载体与表达控制序列有效的结合。这样的载体可用于生产灵长类IL-3样多肽的新方法，其中用编码IL-3样多肽表达的DNA序列转化的细胞系与表达控制序列有效的结合进行培养。所述的这种方法可使用许多已知细胞作为宿主细胞来表达多肽。目前较好的细胞系是哺乳动物细胞系和细菌细胞。
通过对下面的较好实施例进行详细叙述，本发明的其它方面和优点将更加清楚。
本发明所提供的这族灵长类IL-3样生长因子基本上不与其它灵长类的蛋白质结合，其特征在于氨基酸序列与下面表Ⅰ和Ⅱ所示的序列相同或基本相似。这族新的生长因子各成员的特征也是具有至少一种IL-3样生长因子的生物学特性，如下所述。最好证明这族本发明的生长因子中的任一成员具有一种以上的IL-3样生物学特性。
在此定义“IL-3样生物学特性”一词包括一种或多种下列生物学特点和在活体内及体外的活性。一种这样的特性是维持供给红细胞样，淋巴样，和髓样谱系的祖先细胞的生长和分化。例如，在标准人骨髓测定中，IL-3样生物学特性是粒细胞型集落和红细胞样裂解的刺激作用。另一这样的特性是与早期多潜在干细胞相互作用。
IL-3样生物学特性是维持多能前体细胞的生长。另一特性是能够刺激慢性骨髓白血病(CML)细胞增殖。IL-3样生物学特性也可刺激肥大细胞的增殖。IL-3样生长因子还可维持依赖各种因子的细胞系的生长和(或)诱导20-α-甾类脱氢酶(20-α-SPH)和Thy-1抗原的表达。IL-3样的另一生物学特性是刺激KG-1细胞集落形成和(或)刺激在脾骨髓培养物中组胺合成的增加。IL-3还有一种生物学特性就是用还原十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳测得表观分子量约为14～35kd。IL-3的其它生物学特性已在本领域揭示了。
表Ⅰ和Ⅱ所示的特定的肽序列是本发明生长因子族中的两个典型的成员。表Ⅰ的865bp DNA序列是从无尾长臂猿白血病病毒感染的长臂猿T-细胞系UCD-144-MLA的c DNA表达库分离出来的[T.G.Kuwakami et al.，Nature，235170(1972)]。该序列含有一个单一的456个核苷酸的长开放阅读骨架，它编码大约152个氨基酸的蛋白质，称为CSF-80，并且通过高度疏水序列(leu leu leu leu gln leu leu)表明该序列包含一个常规前导分泌序列。成熟蛋白质开始于表Ⅰ中的第20号氨基酸，即丙氨酸。编码区含有3个半胱氨酸，两个在成熟蛋白质中，由此表明有一个二硫键。通过特征序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr说明有两个潜在的天冬酰胺连接的糖基化位点。通过编码序列所显示的大小和糖基化图形是淋巴激活素样蛋白质的特点。865bp区剩余的非编码部分在天然宿主的转录中可能具有调节作用。该序列的3′端也含有包括几个重复序列ATTTA的AT富集片段，被认为与RNA信息稳定性有关[见G.Shaw and R.Kamen，Cell，46(5)659-677(1986)]。
表Ⅰ
用表Ⅰ的序列作为探针从人的基因组库中得到了表Ⅱ的674bp DNA序列[J.J.Toole et al.，Nature，312342-346(1984)]。表Ⅱ的DNA序列最初通过将人的基因组序列的外显子拼接在一起进行构建，通过与表Ⅰ的长臂猿IL-3样多肽的DNA序列比较鉴定了该序列。这种通过人的cDNA克隆的mRNA分析证实的人的序列也可编码大约152个氨基酸的多肽，该多肽是该族灵长类蛋白质中的一员。这种人的多肽包括由高度疏水序列(leu leu leu leu gln leu leu)所示的常规前导分泌序列。成熟多肽开始于表Ⅱ的第20号氨基酸，即丙氨酸。在成熟蛋白质中编码区含有2个半胺氨酸，表明有一个二硫键。通过特征序列Asn-X-Ser说明有两个潜在的无冬酰胺连接的糖基化位点。674bp序列的剩余非编码部分在天然宿主的转录中可能具有调节作用。
人基因[表Ⅱ]外显子的核苷酸序列96%以上与长臂猿基因[表Ⅰ]的DNA序列同源。11个密码子核苷酸序列的变化可导致长臂猿和人蛋白质的氨基酸不同。表Ⅱ序列上面的核苷酸，表明长臂猿序列不同于相关的人序列的位点。与之相似，下面的氨基酸，即人的氨基酸序列表明长臂猿序列不同之处。箭头表明在人基因组序列中外显子和内含子连接的位点。
华盛顿特区的国立生物医学服务结构(National Biomedical Services of Washington，D.C.)的计算机检索揭示了长臂猿和人的IL-3样序列在氨基酸水平上约有29%同源于鼠的IL-3DNA序列，在核苷酸水平上约有45%与鼠的IL-3DNA序列同源，这是M.C.Fung等人在Nature 307233-237(1984)中公开的。人的IL-3样基因的外显子结构与鼠的IL-3编码区相比是类似的。
表Ⅰ所述的新的865bp c DNA序列包括在大肠杆菌HB101质粒中，已于1986年7月11日贮存在A.T.C.C.12301 Parklawn Dr.，Rockville，MD并给定注册号为ATCC 67154。其c DNA序列列于下面的表Ⅱ中的新型基因组序列包括在入噬菌体中，它也已于1986年8月7日贮存在A.T.C.C.并给定注册号为ATCC 40246。包括在大肠杆菌HB101的P SH IL-3-1质粒中的人的IL-3 DNA已于1987年2月24日贮存在ATCC.并给定注册号为ATCC67326。
通过35S标记的蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析进一步描述了典型的人和长臂猿IL-3样多肽的特征，35S-标记的蛋白质来自于转染的COS细胞，见如下所述的实施例。这两种多肽的大小与表观分子量约为14kd-35kd，更确切地说为18kd-30kd的分子种类是异源的。这些典型IL-3样因子的这个分子量范围被认为起因于纯化COS细胞产生分子的糖基化变化。10-100微微克分子浓度的纯化蛋白质在体外人骨髓测定中导致小粒性白细胞型集落的形成。此外，在这些人骨髓测定中促红细胞生成素存在下，这两种多肽可维持红细胞和髓样祖先细胞的生长在类似的活性水平上。因此这些IL-3样因子都是多CSFs。这些IL-3样因子也导致来自患有CML患者的成白细胞的增殖。这些多肽还能够刺激副卫细胞和成熟细胞，如单核细胞，产生其它造血样因子，这些因子又刺激其它造血细胞集落的形成，以及其它造血型细胞的活性。
全部或部分复制表Ⅰ和Ⅱ的氨基酸残基的连续序列的合成多肽也包括在本发明中。这些序列，由于与表Ⅰ和Ⅱ的IL-3样多肽具有共同的一级，二级或三级结构和构象特点，所以可能与此共同具有IL-3样生物学特性。因此，它们可被用作为在治疗和免疫学方法中天然存在的灵长类IL-3样多肽的生物学活性或免疫学替代物。
本发明所提供的这族IL-3样生长因子也包括由与表Ⅰ和Ⅱ相似的序列所编码的因子，但可对这些因子进行自然修饰或有意加以修饰。例如，一种这样修饰的人序列是在表Ⅱ中所说明的人cDNA序列，修饰之处是由三联体CCC编码的27号氨基酸-脯氨酸，而不是在表中该位置上出现的由三联体TCC所编码的丝氨酸。这个典型的修饰的IL-3样序列可产生一种活性人IL-3样因子，它作为p Huc IL3-2包括在大肠杆菌HB101中，于1987年2月13日贮存在ATCC，注册号为ATCC67319。
肽或序列的其它修饰是本领域专业人员可用已知技术进行的。这些IL-3样相关序列的重要的特异修饰可包括用其它氨基酸代替每一编码序列中的两个半胱氨酸残基之一或二者。最好两个半胱氨酸都用其它氨基酸，如丝氨酸，代替，去掉二硫桥。这种取代的诱变技术对于本领域的专业人员来说是人所皆知的。[见，美国专利4，518，584号。]本发明在此所述的其它IL-3样因子的序列的特异性突变包括对一个或两个糖基化位点的修饰。表Ⅰ和表Ⅱ中给出了由于在IL-3样因子序列中天冬酰胺连接的糖基化识别位点发生一个或两个氨基酸取代或缺失所得到的糖基化缺乏或部分糖基化的结果。天冬酰胺连接的糖基化识别位点包括一个三肽序列，该肽能被适宜的细胞糖基化酶特异性地识别。该三肽序列是天冬酰胺-X-苏氨酸或是天冬酰胺-X-丝氨酸，而X一般可是任何氨基酸。在糖基化识别位点的第一或第三位氨基酸中之一或两者上的各种氨基酸取代或缺失(和/或在第二位上的氨基酸缺失)导致修饰过的三肽序列的非糖基化作用。
例如，表Ⅰ中序列的Asn34可由谷氨酸酰胺在一个这样修饰的IL-3样因子中取代。所得到的因子(Gln34)应该仅含一个天冬酰胺连接的糖基部分(位于Asn89)，而不是两个。本专业领域的普通技术人员都将会知道，在34位上取代另一个氨基酸，和/或在糖基化识别位点之内于其它位点取代另一个氨基酸，例如于Ser36插入缬氨酸，可以制备出具有同样Asn89单糖基化的糖蛋白类似物。同样，89位的Asn和/或91位的Ser可由诱变技术转变为其它氨基酸以使因子在该位点上去糖基化。此外，按上述也可使两个位点均改变。对糖基化位点的这种修饰也可用于修饰表Ⅱ中各序列[见A.Miyajima et al.，EMBO J.5(6)1993-1197(1986)和下述的实施例Ⅳ]。本专业领域的普通技术人员在得到此处的揭示后，可以很容易地得到表Ⅰ和表Ⅱ中各序列的其它类似物和衍生物。这类显而易见的修饰包括在本发明的范围之内。
本发明还包括新的DNA序列，它不与编码其它灵长类蛋白的DNA序列结合，并且编码表达灵长类IL-3样多肽或生长因子。这些DNA序列包括在表Ⅰ和表Ⅱ中所述的从5′到3′方向的序列和在严紧控制杂交条件下[见Maniatis et al.，Molecular Cloning(A.Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory
，pagrs 387 to 389]与表Ⅰ和表Ⅱ中各DNA序列杂交的序列。这种严紧控制杂交条件举例如在65℃，4×SSC杂交，然后在65℃，0.1XSSC洗一小时。另外的严紧控制杂交条件如在50%甲酰胺中以42℃4×SSC杂交。
在松驰调控杂交条件下与表Ⅰ或Ⅱ各序列杂交，并且编码表达具灵长类IL-3样生物学性质的生长因子的DNA序列也编码这一族新的生长因子的各成员。这种非严紧控制杂交条件举例如50℃，4×SSC，或用30-40%甲酰胺于42℃杂交。例如，与表Ⅰ和(或)表Ⅱ的序列共有重要同源区，如共有糖基化位点或二硫键的并且编码具一种或更多种IL-3样生物学性质的灵长类蛋白的DNA序列，很明显是编码这一新族生长因子的各成员的，甚至当这种DNA序列不是严紧控制地与表Ⅰ或表Ⅱ的序列相杂交时也是如此。
相似地，能编码由表Ⅰ或Ⅱ的序列编码的灵长类IL-3样多肽，但由于遗传密码的简并性或等位变异(在一种群中自然发生的碱基改变，它可能造成也可能不造成氨基酸的改变)而造成的在密码子序列上有所不同的那些DNA序列，也能编码此处所述的这一族新的生长因子的各成员。本发明还包括由于点突变或为提高活性，延长半衰期或提高由此所编码的多肽生产进行诱导修饰而造成的表Ⅰ和表Ⅱ各DNA序列的改变序列。
本发明的另一方面提供了生产这一新族灵长类IL-3样生长因子的新方法。本发明的方法包括培养适宜的细胞或细胞系，它们是已经被在已知的调节序列控制下编码表达新的灵长类IL-3样多肽的DNA序列所转化。适宜的细胞或细胞系可以是哺乳动物细胞，如中华仓鼠卵巢细胞(CHO)。对适宜的哺乳动物宿主细胞的选择，以及转化、培养、放大、筛选、生产产物和纯化等方法均为已知。例如见Gething and Sambrook，Nature，293620-625(1981)，或Kaufman et al.，Mol.Cell.Biol.Biol.，5(7)1750-1759(1985)或Howley et al.，U.S.Patent 4，419，446。另一种适宜的哺乳动物细胞系在实施例中给出，是猴COS-1细胞系。另一种相似的有用哺乳动物细胞系是CV-1细胞系。
另外适宜作为本发明宿主细胞的是细菌细胞。例如，在生物
权利要求
1.一种基本上不与其它人的多肽结合的人的多肽，其特征在于肽序列与表Ⅱ所示的序列相同或基本相同并具有至少一种ⅠL-3样生物学特性。
2.一种基本上不与其它灵长类多肽结合的灵长类多肽，其特征在于肽序列与表Ⅰ所示的序列相同或基本相同并具有至少一种IL-3样生物学特性。
3.按照权利要求
1或2所述的多肽，其中所述的特性选自下列一组a.用还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测得表观分子量约为14～35千道尔顿;b.在标准人骨髓测定中能够以10-100微微克分子的浓度刺激各种谱系的多种类型造血细胞集落的形成;c.在CML测定中能够以10-100微微克分子的浓度刺激CML细胞增殖;d.等电点为pH6.0～pH7.6;e.在Superose 6凝胶过滤柱上43kd处有一个单一的尖峰;f.在N-聚糖酶处理之后的凝胶上有一个单一的20.5kd的条带;和g.对用Edman降解法分析N-末端的污染水平不大于2%。
4.一个DNA序列，该序列在表达基础上编码具有至少一种IL-3样生物学特性的灵长类多肽并且包括选自下列一组的在5′-3′方向上的核苷酸序列a.表Ⅰ的序列;b.表Ⅱ的序列;c.在严格条件下可与(a)或(b)的DNA序列杂交的DNA序列;d.在非严格条件下可与(a)或(b)的DNA序列杂交并在表达基础上编码具有至少一种IL-3样生物学特性的DNA序列;和e.(a)或(b)序列的等位基因变异。
5.一种载体，该载体包含权利要求
4所述的DNA序列，该序列与表达控制序列有效的结合。
6.一种生产灵长类多肽的方法，该方法包括培养用含有编码IL-3样多肽表达的DNA序列的载体转化的细胞系与表达控制序列有效的结合。
7.按照权利要求
6所述的方法，其中所述的细胞系是哺乳动物细胞系。
8.按照权利要求
6所述的方法，其中所述的细胞系是细菌细胞系。
本发明通过重组技术提供一族新的灵长类IL-3样多肽。
一族新的灵长类造血生长因子制作方法
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