专利名称:分离l半胱氨酸氢氯化物中-水化物的方法本发明涉及从L丝氨酸反应制备的溶液中分离出L半胱氨酸的方法，更具体地是涉及分离L半胱氨酸作为L半胱氨酸氢氯化物的一水化物的方法。L半胱氨酸是一种易氧化的不稳定化合物，因此通常以其氢氯化物的形式销售于市。L半胱氨酸及其氢氯化物主要用作药物或药物原料，或者用作食品或化妆品的添加剂。近来将其用于配制冷烫液，使其需求量更是迅速增长。L半胱氨酸是一种含硫的氨基酸。人们已知有各种不同方法制造L半胱氨酸，这些方法包括(1)从天然物质中提取的方法，(2)有机合成法，(3)发酵法和(4)酶法。但是提取法的缺点在于原料供应极不稳定，而且提取产物很可能含有其他不需要的氨基酸。发酵法的缺点则在于产率低于酶法。因此，从工业应用的角度来看，酶法被认为更优于其他的任何方法。已知有许多用酶合成L半胱氨酸的方法，包括(1)将半胱氨酸合成酶用于由L丝氨酸和硫化氢合成L半胱氨酸的方法，和(2)将丝氨酸硫水化酶(serine sulfhydrase)用于由L丝氨酸和硫化氢或由β氯丙氨酸和硫化氢合成L半胱氨酸的方法。日本专利申请号84545/1985一文公开了由本发明的发明人所发明的方法，该方法将硫氢基合成酶用于L丝氨酸和金属氢硫化物的反应，以生成L半胱氨酸。无论哪一种方法都可以采用，但是要将L半胱氨酸与作为反应产物得到的溶液进行分离却非常困难，因为该溶液含有复杂的组分，而且L半胱氨酸易溶于水。如采用酶法或发酵法，在其反应过程中调整溶液的pH时，或从含水的反应产物中除去细菌杂质时，会形成大量的无机盐，如氯化钠。产物中不可避免地含有作为反应副产物的胱氨酸，此外还含有未被反应的L丝氨酸，需要从中进行耗资颇多的收集工作。尽管为了将L半胱氨酸与任何一种这样的无机盐、未被反应的L丝氨酸和胱氨酸进行分离，都必须纯化反应产物，但是要有效地分离出L半胱氨酸而不造成显著的损失却是一个难题，因为L半胱氨酸在水中的溶解度很高。为此，已知有一种方法，即将反应产物中的L半胱氨酸氧化成为微溶于水的L胱氨酸，而不直接对其进行分离。然后用电解还原等方法，将由此生成的L胱氨酸与反应产物进行分离，再转化为L半胱氨酸。但是从产量、操作和费用的观点来看，该方法对工业应用而言，显然极不稳妥。在这样的情况下，本发明的目的在于提供一种方法，能够克服上面指出的现有技术的缺点，能够有效地将L半胱氨酸与反应产物进行分离。实现该目的的方法是将L半胱氨酸与含有L半胱氨酸、L胱氨酸、L丝氨酸和无机盐的溶液进行分离，包括将盐酸加入该溶液，直至其至少含有15%(重量)盐酸，溶液保持在至少20℃，从中分离出含有L胱氨酸和无机盐的固体，将溶液冷却到不高于10℃，从而结晶分离出另外的固体，同时将L丝氨酸留在溶液中，以生成L半胱氨酸氢氯化物的一水化物，并从溶液中分离出一水化物。图1表示L半胱氨酸在水溶液中的溶解度与分别在0℃、20℃、30℃和40℃时盐酸含量的关系;
图2表示L胱氨酸在水溶液中的溶解度与分别0℃、20℃、30℃和40℃时盐酸含量的关系;
图3表示氯化钠在水溶液中的溶解度与分别在0℃、20℃30℃和40℃时盐酸含量的关系;
图4表示L丝氨酸在水溶液中的溶解度与分别在0℃、20℃、30℃和40℃时盐酸含量的关系。
由于不断努力，结果得到了从L丝氨酸反应产物中分离出L半胱氨酸的有效方法，本发明的发明人发现，反应产物中含有的L半胱氨酸、L丝氨酸、氯化钠和L胱氨酸在含盐酸的水溶液中，其溶解度相互间差别很大，而且还发现这种差别决定于该溶液的盐酸含量及其温度，正如图1至4所示。
在20℃或高于20℃时，L半胱氨酸在含有大约15%(重量)盐酸的水溶液中，其溶解度显著增高，而且在含有大约20%(重量)盐酸的溶液中，溶解度达到最高，但是在盐酸含量更高的溶液中，其溶解度迅速下降，如图1所示。在盐酸含量高于20%(重量)的溶液中，其溶解度在较大程度上决定于温度。另一方面，在盐酸含量约为20%(重量)或更高含量的溶液中，L胱氨酸和氯化钠几乎不溶解，此时温度无关，如图2和图3所示。L丝氨酸在含盐酸的水溶液中的溶解度，随其盐酸含量和温度的增高而相应增高，如图4所示。
因此，根据本发明的方法，将盐酸加到由L丝氨酸反应得到的溶液中，直至该溶液至少含有15%(重量)盐酸，该溶液至少保持在20℃温度下，使含有L胱氨酸和无机盐的固体可首先与溶液分离。然后将该溶液冷却到不高于10℃，结晶出另一些固体，同时将L丝氨酸留于溶液中，使L半胱氨酸可以其氢氯化物一水化物的形式得到分离。
L丝氨酸的反应产物最好通过得率高的酶方法获取。在酶存在下L丝氨酸与硫氢基化合物反应生成L半胱氨酸时，生成的部分L半胱氨酸通过溶解氧的作用、以金属作为酶源等非酶方法，转化为L胱氨酸。因此根据本发明，例如将色氨酸合成酶用作酶，以及采用硫化氢气体代替金属硫化物或氢硫化物等，以引入硫氢基，使整个反应可以保持还原气氛，避免产物L胱氨酸的生成。
当使用色氨酸合成酶时，pH值保持在7.5-9.0是合适的，但如用硫化氢时，由于其系酸性气体，溶液的pH值就降低。为此需加碱性水溶液，借以调整溶液的pH值，但是有些碱性物质会抑制酶反应并且阻碍L丝氨酸较好地转化为L半胱氨酸。例如，氨可以显著抑制反应。氢氧化钾、焦磷酸钾和氢氧化钙也会抑制反应，并能使L丝氨酸不转化为L半胱氨酸，而用氢氧化钠时，则能得到这种转化。因此，将氢氧化钠用作碱，借以调节反应溶液的pH值则是可取的。
尽管没有特别限制有待反应的溶液中可以含有的L丝氨酸的含量，但通常最好含1-2.5%(重量)L丝氨酸。
对溶液中的含酶量没有特别的限制，因为这是决定于各种因素，如所用酶的种类及其活性，以及溶液所含的L丝氨酸量。加入很少量的磷酸吡哆醛作为辅酶，使溶液可含1-50ppm也是可取的。
关于硫化氢的用量，最佳为每摩尔L丝氨酸用1.0-1.3摩尔硫化氢。如硫化氢的用量过大，则由于漏气增加而造成损失。此外，过大量的氢氧化钠必然可以用于调节溶液的pH值，因而也形成了大量不需要的氯化钠。如硫化氢的用量过少，则不能期望得到会满意的反应。最好是将硫化氢吹入溶液，吹气时间为2-12小时。
酶反应的产物含有L半胱氨酸、L胱氨酸、氢氧化钠、未被反应的L丝氨酸和酶(细菌)。将用作酶源的细菌从反应产物中除去，最好先去除细菌，然后从反应产物中分离出L半胱氨酸。除去细菌可用常规方法。将盐酸加入该溶液，直至其pH值不超过0.5，而且除细菌外的其他组分都被溶解。然后加入占L半胱氨酸量的2-10%的吸附剂，如活性炭，溶液至少加热30分钟，可使细菌凝结成絮凝体并与溶液分离。
除去细菌后，通常得到的溶液含有大约5-20%L半胱氨酸、0.5-5%L胱氨酸、0.5-5%OL丝氨酸、3-15%氯化钠和3%盐酸，pH值不大于0.5。
将溶液浓缩到其中L半胱氨酸含量增至25%左右，然后将盐酸气体吹入浓缩溶液，直至其盐酸含量至少为15%，最佳为20-30%(皆以重量计)。如溶液的盐酸含量低于15%(重量)，则全然不可能除去胱氨酸和氯化钠。
将盐酸气体吹入溶液最好是在温度至少为20℃条件下进行。此时，由于溶液的盐酸含量较高，所以氯化钠和L胱氨酸开始沉淀。由于盐酸气体吹入溶液时产生的反应热，溶液的温度升至70℃左右，但是可任其自然。当沉淀的氯化钠和L胱氨酸与溶液分离时，溶液必须保持在温度至少为20℃，最佳为30-40℃。因此，甚至在盐酸气体吹入溶液时，最好也将其保持在温度至少为20℃条件下。如在氯化钠和L胱氨酸与溶液分离时，溶液的温度低于20℃，由于L半胱氨酸氢氯化物的一水化物也会沉淀，所以会发生L半胱氨酸的严重损失。但是，如果溶液温度太高，则可能难以彻底去除所含的杂质。在将这些杂质与溶液分离时，选择溶液所应保持的温度必须考虑到盐酸的含量和其所含的杂质。
在将盐酸吹入溶液后，该溶液需在上述温度条件下至少保持半小时，使氯化钠和L胱氨酸可沉淀结成饼块。去除饼块后，将溶液冷却到温度不超过10℃，最好冷却到10℃至-15℃，可使L半胱氨酸氢氯化物的一水化物沉淀。白色结晶的一水化物通过过滤与L丝氨酸分离，而L丝氨酸则仍保留在溶液中。
将水加入氯化钠和L胱氨酸的饼块，使氯化钠溶解，同时回收L胱氨酸结晶。
由于L半胱氨酸很容易氧化成L胱氨酸，防止L半胱氨酸氧化的有效方法是用氮气密封，或将还原剂加入溶液中。
现参考本发明的实施例，将详细地阐述本发明。用已知的Gaitonde法分析胱氨酸，将待测定的溶液体积稀释1000-2000倍。将5微摩尔的1，4-二硫苏糖醇(还原剂)加入稀释溶液，加入的量大致与稀释溶液相等。再在该溶液中加入2N的NaOH溶液，至其pH值达8.0-8.5，溶液在室温下保持一小时，使其所含的全部胱氨酸可还原为半胱氨酸。用酸性茚三酮试剂使半胱氨酸显色，并用吸收仪在560毫微米处测定其吸光率。根据已知浓度的标准样品在560毫微米处的吸光率所绘制的工作曲线，计算待测溶液中半胱氨酸和胱氨酸的浓度。计算未经1，4-二硫苏糖醇还原的半胱氨酸的浓度。从半胱氨酸和胱氨酸的浓度中减去半胱氨酸的浓度，得到胱氨酸的浓度。
实施例在一只带搅拌器、吹气管和排气管的200毫升分液瓶中，装有10克L丝氨酸和2.5毫克磷酸吡哆醛。加入离子交换水，配制成100克溶液。将32%NaOH溶液加入反应液至其pH值达8.0。然后在分液瓶中装入2.0克(千重)含色氨酸合成酶的细菌，即大肠杆菌[(Escherichiaco-li MT-10242)(FERM BP-20)(CCTCC No.M87037)]，溶液保持在45℃。以大约每分钟10毫升的速率将硫化氢气体吹入溶液，吹气连续约4小时。每摩尔L丝氨酸约用1.1摩尔硫化氢。然后搅拌溶液2小时，使其反应完成。在其反应过程中加入32%的NaOH溶液，使反应系统的pH值保持8.0。使用的NaOH溶液总量约为15克，包括开始用于调节pH值的量。
得到113克反应产物。将产物样品溶于2N的盐酸溶液，通过离心分离去除其中的细菌，分析测定L半胱氨酸和L胱氨酸，得到8.56%的L半胱氨酸和0.50%的L胱氨酸。这些值分别表示由L丝氨酸的转化率为84.0%和5.0%。
将18.2克的35%盐酸溶液搅拌加入反应产物，使其达到pH0.5。在加入1.0克活性炭后，溶液在90℃下搅拌加热一小时，热溶液经吸滤器真空过滤，借以滤去其中的细菌。
溶液浓缩到45克，同时将其保持在45℃温度条件下，将干燥的盐酸气体吹入该溶液，使其达到含有8克(重量百分比约18.9)盐酸的53克溶液。溶液在40℃下再搅拌一小时，然后经吸滤器真空过滤，借以从溶液中分离出氯化钠和L胱氨酸的混合饼块，饼块湿重为7.6克。
将溶液冷却至-10℃，并在此温度条件下保持2小时，从而得到白色结晶的L半胱氨酸氢氯化物的一水化物，经真空过滤从溶液中分离得到9.3克。这个值表示L丝氨酸的回收率为62.0摩尔%。
产品的纯度为99.6%，灰分含量0.02%，[α]20D值为+6.5。产品不含有任何其他的氨基酸，而且产品满足日本工业标准的要求。
将混合饼块溶于20毫升水，在该溶液中加入氢氧化钠，使其pH值达到3左右，从而生成白色结晶的L胱氨酸。经过滤、洗涤和干燥，收集得到0.9克L胱氨酸。


将盐酸加入含有L半胱氨酸、L胱氨酸、L丝氨酸和无机盐的溶液，直至该溶液至少含有15％(重量)盐酸。该溶液保持在至少20℃下，使L胱氨酸和无机盐形成固体，并将该固体从溶液中除去。将溶液冷却到温度不超过10℃，使之产生结晶，生成L半胱氨酸氢氯化物的一水化物。在溶液中将L丝氨酸与一水化物分离。