专利名称：一种发酵麦麸制备阿魏酰低聚糖的方法阿魏酰低聚糖(Feruloyl oligosaccharides,FOs)是阿魏酸(Ferulic acid,FA) 与糖的羟基通过酯键联接成的一类重要的功能性低聚糖，广泛存在于禾本科植物中。上世纪九十年代，研究工作者侧重于FOs的结构解析。已在大麦胚乳、大麦杆、玉米芽、玉米糠等原料中分离到十多种由阿拉伯糖、木糖和阿魏酸组成的FOs。随着研究的深入，人们关注的重点转入FOs抗氧化性和抗病性等方面。据Ohta等报道，FOs抗氧化活性强于阿魏酸。FOs对小鼠红细胞溶血现象具有较强的抑制作用，对狗2+、H2O2和羟自由基具有较强的清除能力；从小麦粉、糙米和鸭脚稗中制得的FOs在DPPH体系和脂质过氧化体系中均具有显著的抗氧化能力。低聚木糖对乳酸菌和双歧杆菌生长有促进作用，对革兰氏阳性菌的生长有抑制作用；在模拟的肠道环境中，低聚木糖可显著改善其微生物菌群，其中乳酸菌等有益菌数量显著增加。此外，低聚木糖可显著抑制白血病人淋巴细胞的生长，促进白血病T细胞的坏疽。由于功能性低聚糖对人体具有特殊的生理活性，因而近年来被广泛用于保健食品中。对于FOs抗肿瘤活性及其构效关系的研究还未见报道。基于FOs具有较强的生物活性，研究工作者努力寻找该低聚糖的来源与高效制备方法。FOs的制备常以禾本科植物为原料，已在大麦胚乳、大麦杆、玉米芽、玉米糠、麦麸和甘蔗渣等原料中水解得到FOs，其中麦麸是制备FOs重要来源之一。研究表明小麦种皮细胞壁中富含咖啡酸、香草酸、阿魏酸等多种酚酸，其中阿魏酸约占麸皮重量的0. 4 0. 7%，因而从麦麸中制备的FOs多以低聚木糖为主链，其侧链的阿拉伯糖连有阿魏酸。目前，制备FOs的方法有物理、化学及生物法(酶处理法和发酵法)等。Devin等采用微波辐射处理玉米麸，以打开其中β _1，4_糖苷键连接的木糖主链， 进而释放FOs。然而随着微波温度的升高和处理时间的延长，FOs逐步分解为阿魏酸和木糖、阿拉伯糖等，导致FOs得率下降。物理法需严格控制处理条件，否则造成产物FOs的分解，且设备购置成本较高，故通常较少使用。也有学者采用0. 05M的三氟乙酸水解玉米麸， 获得了几种不同结构的FOs。此法存在化学物质残留问题，制得的产品难以为医药和食品行业使用，且副产物易造成环境污染。酶法制备FOs是目前较常见的方法。Katapodis等用木聚糖酶水解小麦粉中的不溶性阿拉伯糖基木聚糖获得一种由1分子阿拉伯糖、3分子木糖和1分子阿魏酸组成的 FOs ；Yuan等[3]在优化的木聚糖酶水解麦麸制备FOs的工艺条件下，获得1. 5mM的FOs。 Katapodis等用Thermoascus aurantiacus产生的木聚糖酶水解玉米糠获得FOs。酶法制备FOs具有反应温和、操作简便等优点，但是该方法通常需要从原料中制取不溶性膳食纤维，这样增加了生产环节，提高了生产成本，且产生的大量废水给环境带来巨大压力。若直接将产木聚糖酶的微生物应用于FOs的制备中，使微生物发酵产酶过程与酶解木聚糖获得FOs的过程合二为一，则可省去酶制剂生产中的分离纯化过程，降低生产成本，提高产率。该方法已应用于膳食纤维等产物的制备中。i^erreira等在用链霉菌发酵甜菜浆时，检测到多聚半乳糖醛酸酶、阿魏酸酯酶、FOs和阿魏酸，这表明微生物发酵制备FOs 具有可行性。但是，链霉菌、曲霉菌和青霉菌等发酵过程中均产生水解FOs的阿魏酸酯酶， 不利于制备FOs。因此，在制备FOs时，选育产内切型木聚糖酶、不产或少产阿魏酸酯酶的微生物才具有实际意义。采用发酵法制备FOs的研究报道甚少，以麦麸为原料、食药用真菌为发酵菌株制备FOs的研究尚属空白。木聚糖酶广泛存在于自然界中，已在细菌、酵母、真菌、藻类、蜗牛和陆地植物等生物中分离得到该酶。木聚糖酶在种类、分子量及其作用方式等方面存在显著差异。木聚糖酶有β-1-4木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶等。β-1-4木聚糖酶(xylanase或 1-4- β -D-xylanxylanohydrolase,EC3. 2. 1. 8)是一类能够特异降解木聚糖的酶类，其作用方式是从木糖主链内部作用于木糖苷键，降解产物为木寡糖，所以称为β -1-4木聚糖内切酶。β-木糖苷酶(l-4-^-D-xylan xylohydrolase,EC 3.2.1.37)作用于木寡糖的末端， 释放出木糖残基，它同时能水解木二糖。阿拉伯糖苷酶、阿魏酸酯酶以及乙酰基酯酶等则作用木聚糖结构上相应的侧链取代基。降解木聚糖的微生物通常生成复杂的木聚糖降解酶系。一般情况小，将内切型β-1-4木聚糖酶称之为内切木聚糖酶或木聚糖酶。基于酶催化域的氨基酸序列的同源性，可将内切木聚糖酶分成两个家族-F/10 族、G/11族。不同木聚糖酶分子在其氨基酸组成的数目上相差很大，但催化域的大小较为一致，同一族中的木聚糖酶催化域具有高度同源性。分子量> 30KDa的木聚糖酶属于F/10 族，水解木聚糖速度快，低分子量木聚糖酶(属于G/11族，<30KDa)则水解速度慢；根据木聚糖酶作用的最适PH值，又可分为酸性、中性和碱性木聚糖酶。目前的研究多集中在霉菌产酸性木聚糖酶上。多数木聚糖酶属于中温酶，分子量集中在8 145KDa之间、多为单一亚基蛋白质。微生物发酵培养基中的某些成分(碳、氮源等)对木聚糖酶的合成具有诱导作用。 研究表明木糖和木聚糖可显著提高毕赤酵母和黄萎病病原菌合成的木聚糖酶活性，L-山梨糖、木寡糖及玉米芯、麦麸等有促进菌株合成木聚糖酶的作用，在以麦梗和麦麸为碳源时粗糙麦孢菌合成的纤维素酶、木聚糖酶活性最高，但易为微生物生长利用的葡萄糖和木糖等简单碳源通常对木聚糖酶的合成有阻遏作用；蛋白胨、氨基酸等有机氮源对某些菌株木聚糖酶合成具有促进作用，其中蛋白胨效果最佳；许正宏以育成的短小芽孢杆菌WL-Il为发酵菌株，用富含木糖苷类物质诱导菌株合成木聚糖酶，其中麦麸、木聚糖等是其合成木聚糖酶的良好诱导物；蛋白胨和硫酸铵可促进木聚糖酶的生成；而少量氨基酸可作为木聚糖酶的刺激因子，促进其合成。Seyis等研究结果显示，蔗糖和硫酸铵作为碳、氮源时有利于 Trichoderma harzianum 1073D3合成木聚糖酶。这可能是与微生物所产木聚糖酶的底物特异性有关。有关碳、氮源对食药真菌合成木聚糖酶和水解麦麸制备FOs的调控作用未见报道。发酵液初始pH、溶氧量和发酵温度等条件也影响微生物生长及其产酶效果。 Techapun等对影响耐热性链霉菌发酵产木聚糖酶的溶氧量及摇床转速进行了优化，结果显示在通气量为lvvm、摇床转速为150rpm时该菌合成的木聚糖酶活性最高。Paenikicillus campinasensis BLll在中性pH及高温环境下合成的木聚糖酶活性较高。与通气量相比，发酵温度对Bacilluscirculans产木聚糖酶的影响显著，且随发酵温度的升高，发酵液中木聚糖酶活性呈下降趋势[35]。Chantasingh 等从 Aspergillus terreus (BCC129)克隆到合成木聚糖酶的基因， 其编码的酶蛋白由3 个氨基酸组成，隶属于木聚糖酶F/10族，最适反应温度和pH值分别为60°C和5. O0在Streptomyces olivaceoviridisAl中分离到的木聚糖酶基因，编码191 个氨基酸，属于木聚糖酶G/11族，最适反应温度为60°C、pH为5. 2。在Bacillus subtilis strain R5中的木聚糖酶基因编码分子量为23KDa、由213个氨基酸组成的酶蛋白。不同碳源对青霉纤维素酶基因的表达具有显著影响，其中乳糖、纤维二糖、龙胆二糖、CMC和木聚糖可不同程度地诱导纤维素酶基因的表达，葡萄糖则抑制Neocallimastix frontalis木聚糖酶的合成。从Helminthosporium turcicum中克隆的木聚糖酶基因 htxyll和htxyl2在不同碳、氮源下的表达量存在差异，基因htxyll可在桦树木聚糖或木糖为碳源的培养上高效表达，htxyl2仅在桦树木聚糖为唯一碳源培养时表达，而葡萄糖对两基因的表达均有抑制作用；高浓度的硫酸铵和谷氨酸则抑制基因htxyll的表达，但促进 htxyl2基因的表达。可见，不同的木聚糖酶其高效表达的条件是不同的。Cai等研究结果显示，平菇发酵过程中可释放木聚糖酶，其他食药用真菌合成木聚糖酶及其基因序列的研究未见报道，而培养基组分对食药用菌木聚糖酶基因表达方面的研究尚属空白。麦麸是小麦制粉过程中的副产物。据统计，我国自2005年起小麦年产量达到1. O 亿吨左右(居世界前列)，麦麸产量达1500 2000万吨。目前对麦麸的资源化利用主要集中在麦麸面筋、木糖醇和膨化饲料等方面，而阿拉伯木聚糖、低聚木糖等功能成分的开发尚在研究之中。在酶法生产FOs时通常将麦麸原料中的淀粉、蛋白质及矿质元素等物质除掉。 发酵法生产FOs时，可将麦麸中淀粉、蛋白质等物质作为微生物生长所需的营养成分，使其在消耗这些物质的同时产生木聚糖酶，进而水解麦麸纤维，生成FOs。这将有利于减少酶法制备FOs的生产步骤，降低生产成本，并提高麦麸资源利用率。目前对FOs的研究主要集中在酶法制备及其抗氧化活性方面上，而发酵法制备 FOs的研究鲜见报道，以食药用菌发酵时合成的木聚糖酶制备FOs的研究则报道较少，特别是培养基质及环境条件对木聚糖酶基因表达的影响尚未见报道。有低聚木糖抑制白血病肿瘤细胞的研究报道，但未见FOs抗肿瘤活性的报道。出芽短梗霉在麦麸培养基中能合成高活性的木聚糖酶，采用经诱变获得的出芽短梗霉高产木聚糖内切酶菌株Y进行发酵法制备FOs，研究既可深化发酵法制备FOs的科学理论，又可为FOs保健食品开发提供技术支撑，推动功能性低聚糖的产业化及科学化发展。
本发明的目的利用出芽短梗霉能够分泌高活性木聚糖酶的特性，降解麦麸细胞壁，释放出生物活性物质阿魏酰低聚糖，实现麦麸高效、高附加值利用的价值。本发明的技术方案将麦麸进行相应的预处理后，包括自然晒干或烘干后，经粉碎筛分达到一定粒径后，或经挤压膨化后，或经高温蒸煮后，经出芽短梗霉代谢后产生木聚糖酶，酶解麦麸细胞壁，形成生物活性物质阿魏酰低聚糖。本发明的有益效果出芽短梗霉具有分泌木聚糖酶的特性，能够作用于麦麸中细胞壁多糖的降解，释放出功能性原料阿魏酰低聚糖，从而实现麦麸的高效、高附加值综合利用。研究既可深化发酵法制备FOs的科学理论，又可为FOs保健食品开发提供技术支撑，推动功能性低聚糖的产业化及科学化发展。出芽短梗霉接种量6%，培养7d。木聚糖酶活性参照Dogaris等的方法，以木糖为标准；酶活定义lmL粗酶液单位时间(Imin)于40°C水解桦树木聚糖生成1 μ mol木糖为1个酶活单位(U/mL)。在麦麸处理液中分别添加4g/L的葡萄糖、蔗糖、木糖、木聚糖和乳糖，考察碳源对出芽短梗霉生长及其生成木聚糖酶和FOs的影响，结果见表1。碳源对出芽短梗霉菌体产量及木聚糖酶和FOs的生成影响显著。对出芽短梗霉生长而言，发酵4d时，除蔗糖外，其他碳源均促进了出芽短梗霉菌体的生长，以葡萄糖效果最好，与麦麸处理液相比菌体产量提高27% ；7d时，菌体产量仍以添加葡萄糖组最高，此结果与Kim等研究结果类似。由此说明，葡萄糖可促进出芽短梗霉菌体生长，增加其发酵过程中代谢产物的生成。在麦麸处理液中发酵时，出芽短梗霉可生成木聚糖酶，该酶活性为0. 867U/mL。葡萄糖、蔗糖等碳源对木聚糖酶活性及FOs的影响趋势相似，其中葡萄糖、乳糖和木糖的添加促进了木聚糖酶和FOs的生成，又以葡萄糖和乳糖效果最好。发酵4d 7d范围内，FOs产量呈减少趋势，碳源的添加可阻止FOs的减少。表1碳源对出芽短梗霉生长及木聚糖酶和阿魏酰低聚糖生成的影响Table IEffects of different carbon sources on growth of Pullulan and bio-synthesis of xylanase and FOs本发明涉及微生物发酵法制备麦麸低聚糖的应用。本发明所述的微生物指出芽短梗霉，发酵法生产阿魏酰低聚糖时，可将麦麸中淀粉、蛋白质等物质作为出芽短梗霉生长所需的营养成分，使其在消耗这些物质的同时产生木聚糖酶，进而水解麦麸纤维，生成阿魏酰低聚糖。这将有利于减少酶法制备阿魏酰低聚糖的生产步骤，降低生产成本，并提高麦麸资源利用率。