专利名称：具有皮脂腺样结构的组织工程皮肤及其制备方法大量的临床实验证明，组织工程方法制备的皮肤替代物能够用于创面的修复重建，国内外已有成熟的组织工程全层皮肤产品上市。随着技术的不断进步及人类生活质量的提高，对于组织工程皮肤产品的治疗效果也提出了更高的要求，即组织工程皮肤应具有更完善的功能和更逼真的结构。正常的皮肤含有毛囊、皮脂腺、汗腺等附属器结构。皮脂腺(sebaceousgland)是皮肤中的重要附属器结构，大多位于毛囊和立毛肌之间，为泡状腺，由一个或几个囊状的腺泡与一个共同的短导管构成；导管为复层扁平上皮，多开口于毛囊上段，也有些直接开口在皮肤表面。皮脂腺的发育和分泌受性激素的调节，青春期分泌活跃；皮脂腺的分泌物即为皮脂，是几种脂类的混合物，具有滋润皮肤和杀菌作用。现有的组织工程皮肤不具有皮脂腺附属器，皮脂腺是皮肤中分泌皮脂的功能单位，具有杀菌和滋润皮肤的作用。烧伤形成的创面在移植异体或人工皮肤后，轻微的创面感染都会导致治疗的失败，如果能够给病人移植具有杀菌作用的人工皮肤，将会大大降低术后风险。由于具有皮脂腺样结构的组织工程皮肤能够分泌皮脂，起到杀菌效果，所以，构建具有皮脂腺样结构的组织工程皮肤已成为组织工程领域的重要研究方向。种子细胞是组织工程皮肤的重要组成部分，其生命活力直接决定着组织工程皮肤的治疗效果。间充质干细胞的生命活力与来源组织的年龄有着密切关系，年幼供体组织的间充质干细胞比来源于成年供体组织的同类细胞具有更强的生命活力。所以来自于脐带血、羊膜等分娩时附带组织的细胞是作为组织工程种子细胞的首选。有报道表明，分娩时废弃的胎盘组织能够分离出具有多向分化能力的间充质干细胞，同样来源的羊膜组织能够分离出具有干细胞特性的羊膜上皮细胞。同时本申请人通过研究发现，在体外特定诱导条件下，羊膜上皮细胞能够向皮脂腺泡样细胞分化，这提示我们可以利用特定培养条件下的羊膜上皮细胞来构建组织工程皮肤中的皮脂腺样结构。
本发明的目的是提供一种具有皮脂腺样结构的组织工程皮肤及其制备方法，所提供的组织工程皮肤能够修复皮肤损伤形成的创面，所构建的皮脂腺样结构能够随着组织工程皮肤的降解及被受体新生组织的替代，逐渐将皮脂释放到修复皮肤表面，完成创面的外观修复及皮脂分泌功能，可以降低组织工程皮肤移植后的创面感染风险。本发明提出的具有皮脂腺样结构的组织工程皮肤，包括真皮层和表皮层双层结构，其特征在于，所述的真皮层是由胎盘间充质干细胞均勻分布于凝胶溶液中形成，其中凝胶溶液由无抗原细胞外基质(主要成分为胶原)和具有诱导形成皮脂腺结构作用的蛋白(如DKK1、角蛋白6a等)组成，该凝胶溶液具有诱导生成皮脂腺结构的作用；所述的表皮层是由角质化诱导后的羊膜上皮细胞与未经诱导的羊膜上皮细胞构成；在表皮层与真皮层之间为皮脂腺样结构，该皮脂腺样结构由经皮脂腺方向诱导后的羊膜上皮细胞团构建。本发明具有皮脂腺样结构的组织工程皮肤的制备方法，包括含有胎盘间充质干细胞真皮层的制备、羊膜上皮细胞的角质化方向诱导和皮脂腺方向诱导分化、具有皮脂腺结构诱导作用的凝胶溶液制备、培养液的配制；其特征在于，具体步骤包括步骤一.凝胶溶液、培养液和细胞的准备制备凝胶溶液在无菌条件下，将无抗原细胞外基质溶解于体积浓度为0. 1 % 的乙酸溶液中，使其浓度为5 12mg/ml，将该溶液在冰浴下紫外灯照射；按体积比向该溶液分别加入10%的胎牛血清和10%的DMEM培养基，调pH至7. 2，再分别加入DKKl蛋白(Diclikopfl基因相应的蛋白，成骨细胞分化抑制物)30 150ng/ml，角蛋白6a 100 300ng/ml，丙酸睾酮(TP) 2 X 10_9 3 X 10_7mol/L，得到具有皮脂腺结构诱导作用的凝胶溶液；配制培养液A (胎盘间充质干细胞培养基)其组分按500ml体积计包括，商用培养基α -MEM 450ml、胎牛血清50ml、维生素C 50 150ug/ml、转铁蛋白5 10ug/ml、成纤维细胞生长因子10 20ng/ml ；配制培养液B (羊膜上皮细胞角质化方向诱导培养基)其组分按500ml体积计包括，商用培养基DMEM 360ml、商用培养基FU90ml、胎牛血清50ml、腺嘌呤180 ^OmM、胰岛素2 10mg/ml、转铁蛋白5 10ug/ml、表皮生长因子5 15ng/ml、氢化可的松0. 2 0. 5mg/ml ；配制培养液C (羊膜上皮细胞皮脂腺方向诱导培养基)其组分按500ml体积计包括，商用培养基α-MEM 450ml、胎牛血清50ml、丙酸睾酮2Χ10—9 5X10_8mol/L、转铁蛋白5 10ug/ml、成纤维细胞生长因子10 20ng/ml、DKKl蛋白20 100ng/ml、角蛋白6a 50 100ng/ml ；配制培养液D (组织工程皮脂腺结构真皮培养基)其组分按500ml体积计包括，商用培养基DMEM 300ml、商用培养基F12150ml、胎牛血清50ml、胰岛素样生长因子 6 18ng/ml、表皮生长因子5 15ng/ml、成纤维细胞生长因子5 15ng/ml、丙酸睾酮 2Χ1(Γ9 3Xl(T7mol/L ；配制培养液E (组织工程全层皮肤培养基)其组分按500ml体积计包括，商用培养基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、胰岛素样生长因子6 18ng/ml、表皮生长因子5 15ng/ ml ；将胎盘间充质干细胞用培养液A扩大培养，扩增至所需细胞数量，备用；羊膜上皮细胞角质化方向诱导将获取的羊膜上皮细胞采用培养液B诱导培养10 天，完成羊膜上皮细胞角质化方向的诱导，诱导后的细胞备用；羊膜上皮细胞皮脂腺方向诱导将获取的羊膜上皮细胞采用培养液C诱导培养10 天，完成羊膜上皮细胞皮脂腺方向的诱导，诱导后的细胞备用；步骤二 .组织工程皮肤真皮层的三维构建在上述凝胶溶液中按IO5 IO7个/ml 的细胞浓度加入胎盘间充质干细胞，37°C条件下培养1小时，在凝胶溶液凝固后，加入培养液D，组织工程真皮层构建完成；所构建的组织工程真皮层含有胎儿期的间充质干细胞，生命活力旺盛，移植到创面后比包皮等组织来源的成纤维细胞具有更快的修复能力，缩短创面愈合时间。步骤三.组织工程皮脂腺样结构构建将经皮脂腺方向诱导后的羊膜上皮细胞培养至相互汇合成膜，用质量浓度为0. 05% 0. 2%的胰酶溶液消化0. 5 1. 5分钟，加入培养液C终止消化，吹打羊膜上皮细胞形成的细胞膜片，使其解离成多细胞组成的细胞团，将该细胞团在培养液C悬浮培养12天后，将其接种于步骤二构建的真皮层上，细胞团密度为 100 900个/cm2，加入培养液D培养3天，每天换液；完成组织工程皮脂腺样结构的构建；通过胰酶消化和外力作用使细胞膜片分解成单个的细胞团聚体，再经过皮脂腺方向的诱导培养，细胞膨大，形成类似皮脂腺泡细胞结构，然后将构建的皮脂腺样结构接种至真皮层表面，再经培养液D培养，构建的皮脂腺样结构能够与真皮层表面通过分泌的细胞外基质贴附在一起。步骤四.组织工程皮肤表皮层的构建将经角质化方向诱导后的羊膜上皮细胞与未经诱导的羊膜上皮细胞按3 1的数量比混合，再按4X IO4 8X IO4个/cm2的密度接种于步骤三构建的(表面具有皮脂腺样结构)真皮层上；采用培养液D与培养液E同体积混合的培养液培养2天，每天换液；由于羊膜上皮细胞具有维持表皮层角质化的特点，使用羊膜上皮细胞与角质化诱导的羊膜上皮细胞混合接种于真皮层表面构建表皮层，能够保持表皮层的角质化特征。步骤五.具有皮脂腺样结构的组织工程全层皮肤的培养将步骤四构建的组织工程皮肤换入培养液D与培养液E按2 1体积比混合的培养液培养3天，每天换液；完成具有皮脂腺样结构组织工程皮肤的制备。随着皮脂腺方向的诱导培养继续加强，具有皮质腺泡细胞结构特点的羊膜上皮细胞逐渐膨大，典型的皮脂腺样结构形成。所构建的皮脂腺样结构移植到创面后，随着受体新生组织的形成，组织工程皮肤逐渐降解，羊膜上皮细胞诱导形成的皮脂腺泡样细胞解体，释放出类似皮脂的物质，能够降低移植创面感染的风险，增强修复效果。并且诱导形成的皮质腺泡样细胞及表皮层中羊膜上皮细胞形成的微环境能够加快创面皮脂腺的再生，促进创面更快新生具有完全皮质分泌功能的皮脂腺结构。本发明制备的具有皮脂腺样结构的组织工程皮肤具备现有组织工程皮肤所没有的皮脂腺样结构，使其具有抗菌和滋润皮肤、降低移植后感染风险的应用前景。经大鼠皮肤创面动物试验证实，本发明制备的具有皮脂腺样结构的组织工程皮肤，其创面移植的愈合率为92%，高于对照组(现有组织工程皮肤)移植的愈合率75%，显著提高了组织工程皮肤移植的创面愈合率。由于本发明采用胎盘来源的间充质干细胞和羊膜上皮细胞作为构建组织工程皮肤的种子细胞，保证了所制备皮肤具有极低的免疫排斥风险，能提高皮肤移植成功率；且细胞来源为分娩后废弃组织，原料来源广泛、供体代谢旺盛，所以细胞增殖能力强、传代次数多，有利于种子细胞的规模生产，降低产业化成本。附图1为采用本发明方法制备的具有皮脂腺样结构组织工程皮肤修复大鼠创面的大体照片(四周)，附图2为无皮脂腺结构的组织工程皮肤(对照组)修复大鼠创面的大体照片(四周)。由二图对比可见，采用本发明的组织工程皮肤修复创面的愈合速度明显快于对照组。培养液D的组分按500ml体积计包括，商用培养基DMEM 300ml、商用培养基F12 150ml、胎牛血清50ml、胰岛素样生长因子8ng/ml、表皮生长因子8ng/ml、成纤维细胞生长因子 10ng/ml、丙酸睾酮 2X lO^nol/L ；培养液E的组分按500ml体积计包括，商用培养基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、胰岛素样生长因子15ng/ml、表皮生长因子lOng/ml ；将获取的胎盘间充质干细胞采用培养液A扩大培养，扩增至所需细胞数量，备用；将获取的羊膜上皮细胞采用培养液B诱导培养10天，完成羊膜上皮细胞角质化方向的诱导，诱导后的细胞备用；将获取的羊膜上皮细胞采用培养液C诱导培养10天，完成羊膜上皮细胞皮脂腺方向的诱导，诱导后的细胞备用；步骤二 .组织工程皮肤真皮层的三维构建在制备的凝胶溶液中按IO7个/ml的细胞浓度加入胎盘间充质干细胞，37°C条件下培养1小时，在凝胶溶液凝固后，加入培养液 D，组织工程真皮层构建完成；步骤三.组织工程皮脂腺样结构构建将经皮脂腺方向诱导后的羊膜上皮细胞培养至相互汇合成膜，用质量浓度为0. 的胰酶溶液消化1分钟，迅速加入培养液C终止消化；采用吸管吹打羊膜上皮细胞形成的细胞膜片，使其解离成多细胞团聚的细胞团，将这些细胞团在培养液C悬浮培养12天后，将其接种于步骤二构建的组织工程真皮层上，细胞团密度为200个/cm2，加入培养液D培养3天，每天换液；步骤四.组织工程皮肤表皮层的构建将经角质化方向诱导后的羊膜上皮细胞与未经诱导的羊膜上皮细胞按3 1的数量比混合，再按4X IO4个/cm2的密度接种在步骤三构建的(表面具有皮脂腺样结构)真皮层上；采用培养液D与培养液E同体积混合的培养液培养2天，每天换液；步骤五.具有皮脂腺样结构的组织工程全层皮肤的培养将步骤四构建的组织工程皮肤换入培养液D与培养液E按2 1体积比混合的培养液培养3天，每天换液；完成具有皮脂腺样结构组织工程皮肤的制备。所制备的组织工程真皮具有相对较少的皮脂腺结构单元，适用于手、四肢等生理上皮脂腺结构少、且易暴露部位的皮肤创面修复，皮脂腺结构能够产生皮脂，在创面愈合过程中起到杀灭皮肤表面细菌的作用。
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一种具有皮脂腺样结构的组织工程皮肤，本发明的真皮层是由胎盘间充质干细胞分布于凝胶溶液中形成，其中凝胶溶液由无抗原细胞外基质和具有诱导形成皮脂腺结构作用的蛋白组成，具有诱导生成皮脂腺结构的作用；表皮层是由角质化诱导后的羊膜上皮细胞与未经诱导的羊膜上皮细胞构成；在表皮层与真皮层之间的皮脂腺样结构由皮脂腺方向诱导后的羊膜上皮细胞团构建。本发明的组织工程皮肤有皮脂腺样结构，具有抗菌和滋润皮肤、降低移植后感染风险的应用前景。经动物试验证实，本发明的组织工程皮肤显著提高了移植创面的愈合率和成功率；并且细胞来源广泛、增殖能力强、传代次数多，有利于种子细胞的规模生产，降低产业化成本。