专利名称：结核分枝杆菌rpoB基因的核酸指纹特征图谱库及其用途的制作方法近年来，结核病耐药疫情日趋严重，有关调查表明，超过50个国家存在广泛耐多药结核病患者，中国在全球27个耐多药结核高负担国家中排行第二，仅次于印度。早期耐药性诊断技术的突破是当前控制结核病的关键，因此，建立快速、灵敏的结核病耐药性检测技术迫在眉睫。细菌学的耐药性检测方法仍然是结核病耐药性检测的金标准，但受制于结核分枝杆菌生长缓慢的特性，目前所有的结核病细菌学耐药性检测方法都达不到快速的目的。以耐药基因检测为主的各种分子药敏检测技术具有快速、准确、通量高等优势，越来越 聚合酶亚基β亚单位(RNA polymerase B subunit, rpoB),从而抑制mRNA的转录。结核分枝杆菌对利福平耐药是结核病化疗失败的主要原因，并且利福平耐药性的检测是判断多重耐药结核病(MDR-TB)的标志。rpoB基因是一单拷贝基因，序列高度保守，全长3543个碱基。研究证实，当高度保守核心区域(RRDR)发生突变时，利福平不能与RNA聚合酶β亚单位结合，抑制转录。95%左右的RFP耐药菌株的基因突变都集中在507 533位的27个氨基酸(81bp)组成的区域，其中，以531位Ser — Leu和Trp转换,526位His — Tyr、Asp、Asn和Pro的突变最为常见，且以上两个位点的突变是引起高水平耐药的主要原因。除上述两位点外，511、516、518、522位点也有突变，相对531和526较少，且是引起低水平耐药的原因。已有一些公开文献对结核杆菌的利福平耐药位点决定区(RRDR)进行鉴定，例如，中国专利申请201110271351、“多重PCR-反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌耐药性的方法”，公开了一种基于多重PCR的反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌耐药性的方法，包括了引物的设计、探针的设计、杂交试验、结果判定，能够同时检测结核分枝杆菌对RIF、INH和EMB的耐药相关的rpoB，katG，inhA基因调节区和embB基因突变热点区的碱基突变。然而，该方法需要设计多重引物，并克服多重PCR中引物相互干扰的缺陷，同时多重PCR过程繁琐，且反向斑点杂交技术需要昂贵的免疫生化试剂和大量时间，因此难以实现快速、准确的检测目的。中国专利申请200910114023、“检测结核杆菌耐药基因膜芯片”公开了一种检测结核杆菌耐药基因膜芯片，是针对结核杆菌rpoB、kagG、embB、inhA、ahpC、gyrA、rrs、rpsL、pncA基因的突变位点设计探针并杂交在尼龙膜上进行检测。然而，该方法需要设计多达54种探针，且检测过程中探针点样和膜芯片均需要准确定量和灵敏的洗脱结合等操作，因此也难以实现上述目的。陈双红等(结核杆菌实验诊断的研究进展，《海军医学杂志》第2002年第23卷第2期)综合报道了利用细菌性检测、免疫学检测、PCR诊断、DNA指纹技术、基因芯片检测技术以及质谱分析来分型结核杆菌。其中报道了各种检测方法的优劣点，并指出目前对于rpoB基因突变位点的检测仍然集中于PCR技术，该文对于质谱检测和分析突变位点未作进一步的分析。质谱技术应用于核酸检测领域的理论基础在于，组成遗传物质DNA的基本单元——四种核苷酸之间存在质量差异，如ddAMP、ddCMP、ddGMP、ddTMP的分子量依次为271. 2Da、247. 2Da、287. 2Da、327. IDa (其中ddTMP是经过修饰的)，它们之间的最小分子量差异在16Da，完全可以通过质谱进行分辨。使用质谱能够对碱基突变或多态位点(SNP)、插入/缺失(InDel)、甲基化位点、基因定量、拷贝数变化(copy number variation,CNV)等多种DNA变化类型进行检测。然而，由于质谱技术检测细菌存在着难以确定标准质谱特征图谱的问题。也就是说，尽管不同细菌之间的基因组DNA存在差异，将产生不同的核酸指纹图谱，但如果没有建立标准的质谱图谱数据库，则因为出现每次质谱检测细菌的结果因待检的基因组过于庞大而缺乏重复性，导致准确度下降。例如，朱健等人(“高效液相色谱-电喷雾多级质谱法对格尔德霉素粗品中各组分 的初步判别及分类”，《中国抗生素》，2011年03期)报道了应用高效液相色谱-电喷雾多级质谱法(LC-ESI-MSn)对格尔德霉素(GDM)粗品中各组分进行与质量数相关的结构信息方面的初步判别及分类。该方法针对格尔德霉素(GDM)中不同组分的多级质谱碎片进行的分析整理，并对各种化合物进行了准确分类，但并不涉及针对细菌特定物质进行检测从而对细菌进行分类的方法。刘海洪(“MALDI TOF MS在细菌检测和鉴定中的应用”，《微生物学免疫学进展》，2003年02期)报道了“细菌体内含有大量的生物标志分子能用于细菌的化学分类和鉴定，针对如根据细菌的组成成分获得指纹图谱检测和鉴定细菌”，并对该方法预测其理论上的可行性。然而，该研究仅仅是理论上探讨了利用MALDI TOF MS对细菌进行分类的方向，其既没有指明所针对细菌的何种组分进行检测，也没有说明具体研究方法和过程。由于细菌中可用于分类的组分(如蛋白、DNA、RNA、多糖等)种类太多，且质谱技术针对不同待测物也存在各种实验参数的组合和选择，因此在此之后的近10年内并没有利用MALDI TOF MS进行细菌鉴定的新的报道。中国专利申请201110154723、“MALDI TOF MS辅助鉴定单增李斯特氏菌的方法”和201110154469、“MALDI TOF MS辅助鉴定霍乱弧菌的方法”公开了一种利用MALDI TOF MS技术辅助鉴定细菌的方法，包括预处理细菌培养物，采集所有菌株样品的MALDI TOF MS图谱，根据软件制备细菌标准图谱，使用相同的方法检测并采集待测细菌的图谱，以及比较二者图谱，根据匹配分数进行判定。由于该方法使用常规的处理(通过无水乙醇、甲酸和乙腈处理，并辅以离心，最后吸取上清液进行检测)，尽管其在一定程度上能表征该细菌的特征图谱，但由于其待测物中含有蛋白质、脂类、脂多糖和脂寡糖、DNA、多肽及其它能被离子化的分子，其得到的图谱实质上是上述各种分子的图谱集合，因此既需要处理和比对的图谱信息量过大，并且因待检分子过于庞大而导致其图谱特征性偏低，只适用于某具体细菌而无法推广到其他大量的细菌检测中。由于质谱技术检测细菌存在的上述缺陷，导致目前使用质谱技术检测细菌甚至结核杆菌的耐药突变基因一直没有进展。作为最接近的现有技术，中国专利申请201110178412、“结核杆菌耐药蛋白的筛选方法”报道了一种结合SDS凝胶电泳和质谱技术来筛选结核杆菌耐药蛋白的方法，该方法主要通过凝胶电泳纯化蛋白后，使用液相质谱来分离和鉴定耐药蛋白，并不涉及鉴定耐药基因和相关质谱特征库，因此也无法解决上述问题。因此目前需要新的结核杆菌rpoB基因的耐药突变基因的检测方法(如质谱法)来实现快速、准确、廉价、便捷的分类结果
本发明原理在于针对结核分枝杆菌rpoB基因高度保守核心区域(RRDR)的DNA设计合适的引物进行PCR扩增，然后将PCR产物通过特定内切酶进行消化，产生一系列长度不一丰度不一的核酸片段，并通过MALDI-TOF MS质谱进行核酸分析并形成谱图。由于针对结核分枝杆菌野生型和突变型的rpoB基因RRDR的扩增后酶切，显著的缩小了质谱检测的基因组区域，且通过酶切后的质谱具有稳定的特征图谱，因而实现对利福平耐药性的检测。因此，发明人经过大量摸索和比对，针对结核分枝杆菌野生型及利福平耐药区域71种突变类型的研究，发现选用特定引物对结核分枝杆菌DNA进行PCR扩增，使用特殊酶对扩增产物处理后，进行质谱检测可以得到各种突变型核酸指纹特征图谱。因此，本发明的第一个目的在于提供能用于结核分枝杆菌利福平耐药性检测用途的试剂盒，包含用于扩增结核分枝杆菌DNA的RRDR区域特定引物对，所述引物如下表所示本发明公开了一种检测结核分枝杆菌rpoB基因利福平耐药决定区(RRDR)突变型方法，包括PCR扩增、SAP酶消化、转录、限制性内切酶酶切、纯化、质谱仪检测等步骤。基于该方法，可建立结核分枝杆菌野生型及突变型RRDR的特征酶切质谱峰图数据库。根据实验产生的质谱峰图，与数据库进行比对，以检测结核分枝杆菌rpoB基因RRDR是否突变及突变型，从而判断结核分枝杆菌对利福平的耐药性。检测结果可广泛运用于临床检验、疾病预防、流行病调查、进出口检验等领域。