专利名称：一种大黄欧文氏菌及其在制备低乳糖牛奶中的应用的制作方法一种大黄欧文氏菌及其在制备低乳糖牛奶中的应用乳糖是一种二糖，由一分子葡萄糖和一分子半乳糖缩合而成。它在牛奶中的含量约为4. 5-5.0%。牛奶中的乳糖会导致人体发生乳糖不耐症。全球有约75%成年人有乳糖不耐症，在亚洲约有60-90%患病率，非洲国家高达90-100%，在中国成年人中的发病率达90%。由于国内这么多的人饮用牛乳会导致乳糖不耐症，该病症已妨碍了我国乳品工业的进一步发展。β_半乳糖苷酶(β -galactosidase)又称β -D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β -D-galactoside galacto hydrolase,EC 3· 2· I. 23),商品名为乳糖酶(Lactase),是一种重要的糖苷水解酶，它能将牛乳中的乳糖水解成半乳糖和葡萄糖，因此，利用这种酶可以有效地降低牛乳中的乳糖含量，从而解决牛乳饮用人群的乳糖不耐症问题。β_半乳糖苷酶的来源较为广泛，其中包括来源于大多数植物、动物和微生物等。在工业上，β_半乳糖苷酶往往来源于微生物。到目前为止，研究较多的产乳糖酶的微生物主要有大肠杆菌(Escherichia coli)、乳链球菌(Streptococcus lactis)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、米曲霉(Aspergillusoryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)等。而在工业中应用较多的β _半乳糖苷酶主要来源于酵母和黑曲霉。近年来，随着人们生活水平的提高，乳品工业对乳糖酶的需求越来越多，乳糖酶的研究开发相应增加。目前，工业上使用的β_半乳糖苷酶主要是在中温条件下具有较高活性的中温酶，采用中温半乳糖苷酶对牛乳中乳糖进行水解时，水解反应的温度是约37°C，因此，容易造成在牛乳水解过程中的微生物污染问题。近年来，乳糖酶的一个研究热点是在较低温度下具有较高活性的低温乳糖酶(Cold-adaptive β-Galactosidase),这类酶适合于在较低温度下(例如<20°C)进行牛乳乳糖的水解，较低温度能够防止微生物污染，且低温乳糖酶在牛乳巴氏杀菌温度下能够完全失活，因而可以保证牛乳中乳糖水解度基本一致。CN200710190755 公开了一种大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici) NX-5 株,还涉及利用该大黄欧文氏菌NX-5株生产蔗糖异构酶，再利用这种酶制备异麦芽酮糖。采用该菌株使蔗糖转化率高达99. 5%(W/W)，异麦芽酮糖转化率达90%，转化液中异麦芽酮糖浓度达500g/L，无水解副反应，转化液中几乎不含葡萄糖和果糖，随着反应进行也不会使产物异麦芽酮糖转化为其他成分，对工业化生产异麦芽酮糖十分有益。有关利用大黄欧文氏菌制备半乳糖苷酶及其应用尚未见报道。因此，本发明人在总结现有技术的基础上，通过大量实验研究与分析，终于完成了本发明。发明内 容[要解决的技术问题]本发明的目的是提供一种大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici) E602株。本发明的另一个目的是提供所述大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici) E602株的用途。[技术方案]本发明是通过下述技术方案实现的。本发明涉及一种大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici) E602株,该菌株已于2011年3月17日在北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC No. 4678。本发明还涉及所述的大黄欧文氏菌E602株在生产低乳糖牛奶中的用途。具体地，本发明涉及利用所述的大黄欧文氏菌E602株生产低乳糖牛奶的方法。该方法的步骤如下A、制备一级种子将大黄欧文氏菌E602株甘油冻存管中菌液划线至含IPTG和X-Gal的营养琼脂培养基，在培养箱中在温度24-28°C下培养20-28h ;从该营养琼脂培养基表面挑取蓝色有金属光泽的大黄欧文氏菌E602单菌落，转移至4-6mL LB液体培养基中，在温度24_28°C与转速180-220r/min的条件下培养10_14h，获得一级种子；B、制备二级种子按照以TSA液体培养基体积计1-4%接种量，将步骤A)得到的一级种子接种至45-55mL TSA液体培养基中，在温度24_28°C与转速180_220r/min的条件下培养12_18h，获得二级种子；C、发酵培养按照以TSA液体培养基体积计1-4%接种量，将步骤B)得到的二级种子接种至4-6L TSA液体培养基中，在温度24-30°C与转速180_220r/min与不通气的条件下发酵12-20h，然后进行离心分离，收集含β-半乳糖苷酶的菌体；D、分离β-半乳糖苷酶收集在步骤C)得到的含β -半乳糖苷酶的菌体，在重悬于磷酸盐缓冲液后，将得到的重悬液于冰浴中进行超声波破碎，然后进行离心分离，收获上清液。向得到的上清液中添加硫酸铵粉末，在其饱和度达到20-60%的硫酸铵溶液中进行硫酸铵盐析，再进行离心分离，其沉淀物用磷酸盐缓冲液重悬，接着透析除去硫酸铵，再进行离心分离，其上清液再进行阴离子交换色谱层析与凝胶色谱层析分离，于是得到纯β_半乳糖苷酶；Ε、制备低乳糖牛奶往新鲜牛乳中加入在步骤D)得到的β -半乳糖苷酶，使牛乳中β -半乳糖苷酶的浓度达到2. 0-30. OU/mL，然后在温度0-40°C水浴中进行水解4-20h，得到一种低乳糖牛奶。根据本发明的一种优选实施方式，所述的超声波破碎是在超声波功率200-500W的条件下进行超声处理500-700次。根据本发明的另一种优选实施方式，在超声波破碎后，所述的离心分离是在18000-22000r/min与温度0-6°C的条件下进行离心20_40min。根据本发明的另一种优选实施方式，在硫酸铵盐析后，所述的离心分离是在8000-12000r/min与温度0-6°C的条件下进行离心8_12min。 根据本发明的另一种优选实施方式，在如下的条件下进行离子交换色谱层析分离DEAE FF阴离子交换柱，流动相A为20mmol/L Tri-HCl溶液，ρΗ7· 0-7. 5 ;流动相B为20mmol/L Tri-HCl 和 2mol/L NaCl 的溶液，pH7. 0-7. 5，上样流速为 2_5mL/min，洗脱流速为4-8mL/min，在波长280nm处测定紫外光吸收度。根据本发明的另一种优选实施方式，在如下的条件下进行凝胶色谱层析分离Sephacry S-100凝胶柱，流动相为50mmol/L磷酸盐缓冲溶液和0-100. Ommol/LNaCl的溶液，pH 7. 0-7. 5，上样流速为O. 4-2. OmL/min,洗脱流速为O. 4-2. OmL/min,在波长280nm处测定紫外光吸收度。在步骤D)得到的β -半乳糖苷酶在ρΗ4. 0-9. O范围内具有良好的酶活性。β -半乳糖苷酶酶活测定方法如下将5mL 50mg/100mL邻-硝基苯-β _D_半乳糖吡喃糖苷(ONPG)底物溶液与O. 9mL磷酸缓冲盐溶液混合后，往其中加入O. ImL根据权利要求2所述方法制备的酶液，在水浴内于温度40°C的条件下反应lOmin，然后往其中加入2mL75g/L Na2CO3溶液终止酶反应，再在温度25 °C的水浴中放置15min，接着在波长420nm处测定吸光度，由该吸光度值根据下式计算出β-半乳糖苷酶酶活β -半乳糖苷酶酶活(U/mL) = (EXVI)/(4. 45X tXV2)式中E :反应混合物在420nm处的吸光度，VI 反应混合物的总体积，mL，V2 :加入该体系中的酶液体积，mL，t:反应时间，min,4. 45-在该试验条件下I μ mol/mL邻-硝基苯(ONP)的吸光度。本发明涉及采用上述方法制备得到的低乳糖牛奶，其特征在于与牛奶相比，所述低乳糖牛奶中的乳糖含量低60%以上。下面将更详细地描述本发明。本发明涉及一种大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)E602株,该菌株已于2011年3月17日在北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC No. 4678。大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)E602菌株具有下述性质I、菌落形态学特征在含IPTG和X-Gal的营养琼脂培养基上，在温度26°C下培养24h出现蓝色菌落，这种菌落呈圆形，表面光滑，中央突起，不透明，适当延长培养，菌落会逐渐增大，而细胞尺寸和形状变化却很小。2、生理与生化特征培养温度25_30°C，最适温度为26°C。在ρΗ7· 3-7. 5范围内生长。3、营养特征在大黄欧文氏菌Ε602株的培养基中不需要额外添加生长因子，使用有机氮作为氮源。将该菌株E602株接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行无氧发酵，离心得到含半乳糖苷酶的细胞，通过超声波破碎、硫酸铵盐析、离子交换色谱层析、凝胶色谱层析等方法得到纯β_半乳糖苷酶，进而利用该纯β_半乳糖苷酶进行低乳糖牛奶的生产。本发明还涉及所述的大黄欧文氏菌Ε602株在生产低乳糖牛奶中的用途。具体地，本发明涉及利用所述的大黄欧文氏菌Ε602株生产低乳糖牛奶的方法。该方法的步骤如下 Α、制备一级种子将大黄欧文氏菌Ε602株甘油冻存管中菌液划线至含IPTG和X-Gal的营养琼脂培养基，在培养箱中于温度24-28°C下培养20-28h ;从营养琼脂培养基表面挑取蓝色有金属光泽的大黄欧文氏菌E602单菌落，转移至4-6mLLB液体培养基中，在温度24-28°C与转速180-220r/min的条件下培养10_14h，获得一级种子；含IPTG和X-Gal的营养琼脂培养基制备方法如下按照20g/L蛋白胨、3g/L酵母提取物、2. 5g/L磷酸氢二钾,5g/L氯化钠、15g/L琼脂称取这些组分，再用水溶解，然后用氢氧化钠溶液或盐酸溶液将其溶液的pH调节至7. 3-7. 5,再在温度121°C下灭菌20min,接着添加X-Gal (5-漠-4-氣-3- Π引噪-β -D-半乳糖苷)，使其终浓度达到40 μ g/mL,然后添加IPTG (异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)，使其终浓度达到20 μ g/mL，然后浇铸成含IPTG和X-Gal的营养琼脂培养基。LB (Luria-Bertani)液体培养基组成如下10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠，其余组分为水。TSA液体培养基组成如下15g/L胰蛋白胨、5g/L大豆蛋白胨、2. 5g/L磷酸氢二钾、2. 5g/L乳糖、5g/L氯化钠、3g/L酵母浸膏、其余组分为水，pH 7. 3-7. 5。优选地,大黄欧文氏菌E602株在培养箱中在温度26°C下培养26h。挑选蓝色有金属光泽的大黄欧文氏菌E602株单菌落接种至5mL LB液体培养基中，在温度26°C与转速200r/min的条件下培养12h。B、制备二级种子按照以TSA液体培养基体积计1-4%接种量，将步骤A)得到的一级种子接种至45-55mL TSA液体培养基中，在温度24_28°C与转速180_220r/min的条件下培养12_18h，获得二级种子。优选地，步骤A)得到的一级种子接种量是以TSA液体培养基体积计2-3%。步骤A)得到的一级种子在50mL TSA液体培养基中在温度26°C与转速200r/min的条件下培养16h。C、发酵培养按照以TSA液体培养基体积计1-4%接种量，将步骤B)得到的二级种子接种至4-6L TSA液体培养基中，在温度24-30°C与转速180_220r/min与不通气的条件下发酵12-20h，然后进行离心分离，收集含β -半乳糖苷酶的菌体。优选地，步骤B)得到的二级种子接种量是以TSA液体培养基体积计2-3%。步骤B)得到的二级种子在5L TSA液体培养基中在温度26°C与转速200r/min与不通气的条件下培养16h。根据本发明，所述的不通气应该理解是在培养过程中将培养容器封闭，不让培养容器内的环境与外部环境交流的一种封闭式不通气培养。所述的离心分离是在3000-5000r/min与温度15-30 °C的条件下进行离心10_15minoD、分离半乳糖苷酶收集在步骤C)得到的含β -半乳糖苷酶的菌体，在重悬于磷酸盐缓冲液后，将得到的重悬液于冰浴中进行超声波破碎，然后进行离心分离，向得到的上清液中添加硫酸铵粉末，在硫酸铵饱和度达到20-60 %的溶液中进行硫酸铵盐析，再进行离心分离，其沉淀物用磷酸盐缓冲液重悬，接着透析除去硫酸铵，再进行离心分离，收获上清液；所得上清液再进行阴离子交换色谱层析与凝胶色谱层析分离，于是得到纯β-半乳糖苷酶； 在步骤C)得到的菌体在重悬于磷酸盐缓冲液后，得到的重悬液于冰浴中进行超声破碎。在超声波功率200-500W的条件下进行超声3s，暂停8s，按照这种方式连续超声500-700 次，共 30min。超声波破碎是使用超声波破碎仪通过换能器将电能转换为超声波,这种形式的能量在通过液体介质时使其介质变成一个个小气泡，这些小气泡会迅速炸裂，从而使细胞破碎。超声波破碎使用的细胞超声波破碎仪是目前市场上销售的产品，例如上海靖永实业有限公司销售的产品。在超声破碎后获得的菌液然后进行离心分离，移取其上清液。这种离心分离是在18000-22000r/min与温度0-6°C的条件下进行离心20_40min。这种离心分离使用的离心机是目前市场上销售的产品，例如德国SIGMA公司、长沙英泰仪器有限公司生产的产品。将所述的上清液置于冰浴中，在磁力搅拌器的搅拌下，加入硫酸铵粉末，在硫酸铵饱和度达到20-60%的溶液中进行硫酸铵盐析。所述的硫酸铵盐析主要是使蛋白质和酶盐析出来。硫酸铵的优点是温度系数小，溶解度大，许多蛋白质和酶都可以盐析出来，还不易引起蛋白质变性。盐析时，硫酸铵溶液的pH通常是4. 5-5. 5。在硫酸铵盐析后进行离心分离所得到的沉淀物是蛋白质。蛋白质在通过盐析沉淀分离后，需要将其中的盐除去，常用的方法是透析。得到的沉淀物使用PH7. 4磷酸盐缓冲液溶解，装入透析袋进行充分透析，在透析过程中需要更换磷酸盐缓冲液2-5次，使用萘氏试剂检测透析外液无黄色，即无NH4+为止，已无硫酸铵盐。在硫酸铵盐析后，所述的离心分离是在8000_12000r/min与温度0_6°C的条件下进行离心8-12min。这种离心分离得到的上清液再进行阴离子交换色谱层析与凝胶色谱层析分离，可以得到纯半乳糖苷酶。离子交换色谱层析分离在如下的条件下进行DEAE FF阴离子交换柱，流动相A为20mmol/L Tri-HCl 溶液，ρΗ7· 0-7. 5 ;流动相 B 为 20mmol/LTri-HCl 和 2mol/L NaCl 的溶液，PH7. 0-7. 5，上样流速为2-5mL/min，洗脱流速为4_8mL/min，在波长280nm处测定紫外光吸收度。根据测定的紫外光吸收度值曲线，收集与吸收度最大值对应的洗脱部分。重复这个收集步骤，将这些洗脱部分合并，然后再进行凝胶色谱层析分离。凝胶色谱层析分离在如下的条件下进行Sephacry S-100凝胶柱，流动相为50mmol/L磷酸盐缓冲溶液和0-100. Ommol/L NaCl的溶液，pH 7. 0-7. 5，上样流速为O. 4-2. OmL/min，洗脱流速为O. 4-2. OmL/min，在波长280nm处测定紫外光吸收度。根据测定的紫外光吸收度值曲线，收集与吸收度最大值对应的洗脱部分。重复这个收集步骤，将这些洗脱部分合并，得到纯的β -半乳糖苷酶。接着测定β -半乳糖苷酶酶活，其测定方法如下将5mL 50mg/100mL邻-硝基苯-β -D-半乳糖吡喃糖苷(ONPG)底物溶液与O. 9mL磷酸盐缓冲溶液混合后，往其中加入
O.ImL本发明方法制备的β-半乳糖苷酶液，在水浴内在温度40°C的条件下反应lOmin，然后往其中加入2mL 75g/L似20)3溶液终止酶反应，再在温度25°C的水浴中放置15min，接着在波长420nm处测定吸光度，由该吸光度值根据下式计算出β _半乳糖苷酶酶活β -半乳糖苷酶酶活(U/mL) = (EXVI)/(4. 45X tXV2)式中E :反应混合物在420nm处的吸光度，VI 反应混合物的总体积，mL，V2 :加入该体系中的酶液体积，mL，t:反应时间，min,4. 45-在该试验条件下I μ mol/mL邻-硝基苯(ONP)的吸光度。大黄欧文氏菌E602菌株所产的β -半乳糖苷酶与其他来源的β -半乳糖苷酶在性质方面进行了比较，其结果列于表I中。表I :大黄欧文氏菌Ε602所产的β -半乳糖苷酶与其他来源的β -半乳糖苷酶性质比较


本发明涉及一种大黄欧文氏菌E602株，还涉及所述大黄欧文氏菌E602株在生产低乳糖牛奶中的用途。生产低乳糖牛奶的方法包括一级种子、二级种子制备、发酵培养、分离纯化β-半乳糖苷酶，以及制备低乳糖牛奶等步骤。该β-半乳糖苷酶最适宜的反应温度为40℃，最适宜的反应pH为7.0，在低温下存在良好的酶活性。采用不同终浓度的β-半乳糖苷酶在温度20℃下水解牛奶12h，使牛奶中的乳糖水解率达到60％以上，达到低乳糖牛奶的生产要求。