专利名称：钙泊三醇一水化合物纳米晶体的制作方法银屑病是慢性炎性皮肤疾病，其表现为由于表皮角化病造成的红斑状、干燥、鳞状斑块。斑块最常见于肘、膝和头皮，尽管更多的病灶可能出现在身体的其他部分，特别是腰骶区域。轻度至中度银屑病的最常见治疗涉及含皮质类固醇作为活性成分的组合物的局部应用。尽管有效，但皮质类固醇具有许多副作用的缺点，例如皮肤萎缩、条纹(striae)、痤疮样皮疹、口周皮炎、皮肤真菌和细菌的过度生长、色素皮肤着色不足和酒渣鼻。然而，多年来，银屑病的有利的非类固醇治疗在于用配制在软膏组合物中的维 生素D类似物钙泊三醇的局部治疗(由LEO Pharma作为Daivonex 成Dovonex 软膏销售)，其中钙泊三醇存在于溶剂或乳膏组合物中(由LEO Pharma以Daivonex 或Dovmiex 乳膏销售)，其中钙泊3醇以微粒的悬浮液形式存在。软膏纟且合物中的溶剂是丙二醇，其具有增强活性成分穿透进入皮肤的优点，导致效力的改善，但已知其还作为皮肤刺激剂。因此，据报道，在局部组合物中包含丙二醇通常会造成患者发展成接触性皮炎(一项研究报道了 12. 5%的丙二醇的大量刺激反应,参见M. Hannuksela等人，ContactDermatitis 1，1975，第112-116页)，且当以高浓度使用丙二醇时，刺激反应的数量增加(如 J. Catanzaro 和 J. Graham Smith, J. Am. Acad. Dermatol. 24,1991,第 90-95 页综述)。尤其由于丙二醇的存在而导致了钙泊三醇穿透进入皮肤的改善，已经发现Daivonex 软骨比Daivonex 乳骨在治疗银屑病病灶中更有效，但也在很大一部分银屑病患者中造成了皮肤刺激。发明概述人类皮肤、特别地外层角质层提供了抗微生物病原体和毒素化学物质侵入的有效屏障。尽管皮肤的这种性质通常是有利的，但其复杂化了药物的皮肤施用，因为应用在患皮肤疾病的患者皮肤上的大量-即使不是大多数-活性成分可能不会渗入到其发挥其活性的皮肤的有活力层。为了确保活性成分充分地穿透到真皮和表皮中，一般优选地以溶解状态包含活性成分，一般地在以醇如乙醇或者二醇如丙二醇的形式的溶剂存在下。丙二醇是熟知的渗透增强剂，即能穿透角质层并将低分子组分例如载体中的治疗性活性组分“拉入到”表皮中的物质。丙二醇本身可能会引起显著的皮肤刺激，并且其还能将载体的低分子和可能刺激组分“拉入到”表皮中，造成常规载体包括丙二醇的总体刺激作用。为此，旨在治疗炎症皮肤疾病的在组合物中作为溶剂存在的丙二醇可能加重炎症应答。在产生本发明的研究中，目的是提供包含钙泊三醇作为活性成分的局部组合物，其具有与Daivonex 软膏那些相当的皮肤穿透性和生物学活性特性，但其不含丙二醇作为溶剂。已经令人惊奇地发现，可能制备纳米晶体形式的化学稳定的(即不会降解成24-表钙泊三醇或其他降解产物)钙泊三醇一水合物，因为出乎意料地，纳米化期间，没有显著量的无定形钙泊三醇因高应力或冲击力或者高温而形成。此外，纳米晶体是物理稳定的，因为在制备后，在纳米晶体的悬浮液中没有观察到聚集或晶体生长或者晶体(多态)形式的改变。纳米晶体可以容易地配制到局部乳膏和软膏组合物中，从中钙泊三醇(一水合物)可以以与来自Daivonex 软膏的钙泊三醇穿透的相当的量渗透到皮肤的活力层(即真皮层和表皮层)中，并产生类似或更高水平的生物学活性(如通过靶基因的体外活化所测定)，而不用借助于包含穿透增强剂如丙二醇(其是潜在的皮肤刺激剂)。因此，本发明的一个方面涉及如动态光散射所测定颗粒大小分布为200_600nm的纳米晶体形式的钙泊三醇一水合物的悬浮液，该悬浮液还包含水相，所述水相包括足以防止钙泊三醇一水合物纳米晶体聚集物形成和/或晶体生长的量的非离子、聚合物表面活性剂。另一方面，本发明涉及如动态光散射所测定颗粒大小分布为200-600nm的纳米晶体形式的钙泊三醇一水合物，所述纳米晶体可通过包括以下步骤的方法获得 (a)将包含所述水相重量约1%至约5%的非离子、聚合物表面活性剂的水相中的晶态钙泊三醇一水合物缩减，导致微粒的形成，所述微粒的颗粒大小分布为约5-20 y m，平均颗粒大小约10 ii m ;(b)在约300-800巴的压力下，将步骤(a)的所述悬浮液进行第一个循环的高压均化一段时间，所述一段时间足以获得约15-40%的颗粒大小分布为200-600nm的钙泊三醇一水合物的晶体；(c)在约800-1200巴的压力下，将步骤(b)的所述悬浮液进行第二个循环的高压均化一段时间，所述一段时间足以获得约40-80%的颗粒大小分布为200-600nm的钙泊三醇一水合物的晶体；(d)在约1200-1700巴的压力下，将步骤(C)的所述悬浮液进行第三个循环的高压均化一段时间，所述一段时间足以获得约90%或更多的颗粒大小分布为200-600nm的钙泊三醇一水合物的晶体；和(e)任选地从水相中分离所得钙泊三醇一水合物的纳米晶体。另一方面，本发明涉及包含上述钙泊三醇一水合物纳米晶体和可药用载体的药物组合物。在又一方面，本发明涉及包含钙泊三醇一水合物纳米晶体或纳米悬浮液的组合物的用途，用于治疗皮肤疾病或病症，例如银屑病、脂溢性银屑病、掌跖脓疱病、皮炎、干皮病鱼鳞癣、酒渣鼻或痤疮。附图简述图I是显示如动态光散射测定的、通过本方法制备的钙泊三醇一水合物纳米晶体的颗粒大小分布的图。图2a是将在2%泊洛沙姆188中钙泊三醇一水合物纳米悬浮液的拉曼光谱与没有进行纳米化的钙泊三醇一水合物的拉曼光谱比较的图。该图显示本发明的纳米化方法并没有导致钙泊三醇一水合物晶形的任何改变。图2b和2c是显示通过本方法制备的两批钙泊三醇一水合物纳米晶体的差示扫描量热法(DSC)分析的结果的图。在100°C /分钟(图2b)和在100°C /分钟(实线)、300°C /分钟(虚线)，以及500°C /分钟(短划线)(图2c)进行DSC。图中稍微更宽的线反映了在约8°C发生的放热事件，认为是由于无定形钙泊三醇的结晶所致。图3是显示与Daivonex 软膏的释放率比较，钙泊三醇自本纳米悬浮液的释放率的图。该图显示，纳米悬浮液制剂的释放率显著地高于Daivonex 软膏的释放率。“纳米悬浮液乳膏”是根据实施例3的乳膏。“纳米悬浮液.软膏.含水”相当于没有甘油的实施例2的组合物A，而“纳米悬浮液.软膏.甘油”是实施例2的组合物A。图4a是显示自两种纳米悬浮液软膏即实施例2的组合物A和C穿透进入皮肤并流入皮肤的图。“WSP软膏”是组合物A，而“Sonnecone软膏”是组合物C。图4b是显示与Daivonex 软膏比较，钙泊三醇自本发明纳米悬浮液软膏组合物A、C和D穿透进入皮肤并流入皮肤的图。该图显示，自纳米悬浮液软膏进入活力皮肤的穿透性与Daivonex 软膏相当，而流量显著更低，导致了钙泊三醇的更少全身性暴露。图5是显示与Daivonex 乳膏比较，钙泊三醇自本发明纳米悬浮液乳膏穿透进 入皮肤并流入皮肤的图。该图显示，钙泊三醇自纳米悬浮液乳膏进入活力皮肤的穿透性显著地高于Daivonex 乳膏。图6是人角质细胞中通过维生素D3活化编码抗菌肽(cathelicidin)的基因的略图。抗菌肽基因活化的机制被用于生物学测定中，所述测定使用重构人表皮(培养的人角质细胞，以形成人皮肤的表皮层特征)，在该表皮上应用含钙泊三醇的本发明组合物以活化抗菌肽，如下文实施例8中所详述。发明详述定义在本发明的上下文中，术语“纳米晶体”意指钙泊三醇一水合物的晶体颗粒，其呈纳米大小范围，即直径在I-IOOOnm之间。纳米晶体有利地具有这样的颗粒大小分布彡90%的纳米晶体具有100-900nm之间、特别地200_600nm之间的颗粒大小。术语“纳米悬浮液”意指悬浮在水相中的如上所定义的纳米晶体。术语“颗粒大小分布”意指根据厂商说明书(可得自Malvern Instruments,英国)、使用Zetasizer Nano ZS或ZS90、通过动态光散射(也称为光子关联光谱学)测定的最小和最大钙泊三醇一水合物晶体之间的跨度。动态光散射通过用激光照射颗粒并分析由于流体中颗粒的布朗运动产生的散射光中的强度波动来测定悬浮在液体中的固体颗粒的大小。强度波动与颗粒大小相关，因为较大的颗粒比较小颗粒移动更慢，即强度波动更慢。术语“无定形”意指其分子没有有序排列的固体物质，即晶态的对立面。“钙泊三醇”为式通过本发明所公开的方法制备的钙泊三醇一水合物纳米晶体可掺入到用于预防或治疗皮肤疾病和病症的药物组合物中。