专利名称：一步法半巢式筛选人乳头瘤病毒的方法人乳头瘤病毒(Human papillomavirlls, HPV)属于乳多空病毒科的乳头瘤病毒属，HPV于1949年由Strauss在电镜下发现，是一种小的环状双链DNA病毒，其基因组长度约8000bp。目前已经确定的HPV亚型有100余种，依其感染的上皮所在部位分为皮肤型HPV 和生殖道上皮型HPV，大约30多种型别可感染妇女生殖道,其中约20种与肿瘤相关。依据HPV不同亚型与肿瘤发生的危险性高低分为低危型和高危型HPV，由于不同亚型HPV的致病机制和致癌危险性各不相同，因此对HPV各亚型进行分型检测有重要的临床意义。由于HPV不能在体外细胞培养，故不能用简单的血清学检测进行HPV的诊断和分型。目前主要是通过应用分子生物学方法进行HPV DNA的检测。在临床实验室中，目前检测HPV的常用方法经常是普通多聚酶链反应(PCR)，多色荧光实时PCR，由于HPV的类型很多，而且设计共同引物比较困难，所以经常采用两步巢式PCR的方法，即先做外侧PCR，然后用外侧PCR产物为模板来做第二次PCR，操作繁琐，而且容易污染。所以不利于实验室大批量的样本检测。实时荧光PCR (real-time PCR)技术实现了 PCR从定性到定量的飞跃。其以特异性强、灵敏度高、自动化、重复性好、定量准确、全封闭反应等优点，成为分子生物学和分子诊断的重要技术平台，并广泛应用于遗传病、病原体和肿瘤等方面的检测和诊断。在病原体检测方面，实时荧光PCR技术已应用于肝病、性病以及人类免疫缺陷病毒(HIV)等的临床诊断。而在肿瘤诊断方面，实时荧光PCR技术正成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备工具。实时荧光PCR技术发展已相当成熟；其操作简单，自动化程度高，耗时短，结果易于判断；且能满足临床实验室的高通量要求。
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明将实时荧光PCR技术和一步法半巢式PCR技术结合起来应用于HPV病毒基因检测，开发了一种新型的HPV基因筛选的检测方法。一步法半巢式筛选人乳头瘤病毒的方法，采用SYBR Green法实时荧光PCR进行HPV病毒基因检测，其特征在于，采用以下简并引物扩增HPV基因HPV-out1-Forward TGTCCA/CAA/GA/GGGAA/TACTGAGG ；HPV-out2-Reverse AAGCA/CCAGGGA/TCATAAC/T AATGC ；HPV-in AAGAAAAATAAACTGTAAATCATATT。(其中“/”表示简并)进一步地，所述实时荧光PCR反应液包括1. 5mM MgCl2, 200mM dNTP混合物，IOpmolHPV-outl-Reverse 和 HPV-in 引物，2. 5pmol HPV-oul-Forward 引物，20ulPCR反应体系含有IU 的多聚酶和 Iul 10XSYBR Green。更进一步地，所述实时荧光PCR扩增条件为95 1为3分钟；95°C 30秒、53 V30秒、72 V 30秒，共10循环；95 V 30秒、40 V 30秒、72 V 30秒，共30循环；最后延长72 V 10分钟。本发明通过对30多种HPV的亚型的研究，发现在所有HPV的LI区能找到它们的共同上下游序列，所以引物设计为

本发明公开了一步法半巢式筛选人乳头瘤病毒的方法，采用SYBRGreen法实时荧光PCR进行HPV病毒基因检测，其特征在于，采用以下简并引物扩增HPV基因HPV-out1-ForwardTGTCCA/CAA/GA/GGGAA/TACTGAGG；HPV-out2-ReverseAAGCA/CCAGGGA/TCATAAC/TAATGC；HPV-inAAGAAAAATAAACTGTAAATCATATT。本发明用一步法即可对HPV基因进行检测，避免了传统两步巢式PCR方法需要进行两次PCR、操作繁琐易产生污染的弊端，且特异性好，灵敏度高。