专利名称：水稻OsCUT1基因的抗旱性基因工程应用的制作方法水稻OsCUTI基因的抗旱性基因工程应用技术领域本发明属于基因工程领域，涉及水稻Os⑶Tl基因的抗旱性基因工程应用。 技术背景超长链脂肪酸(very long chain fatty acids, VLCFAs)在生物体中具有广泛的生理功能，为角质层蜡质的生物合成提供前体物质。角质层是覆盖在植物地上部分最表层的保护层，由角质和蜡质组成，在植物生长发育、适应外界环境方面起重要作用。干旱胁迫下，很多植物的表皮蜡质含量都会增加，蜡质含量的高低可能与植物的抗旱性有关。 Aharoni等Q004)在模式植物拟南芥中用激活标签法筛选出获得功能性突变体，其抗旱性和干旱复水后的再生能力显著提高。进一步分析发现，转座子激活了一个植物特有的转录因子，使得突变体的蜡质含量比野生型高6倍。^iang等000 将豆科植物的一个AP2转录因子WXPl基因在苜蓿中过量表达，结果诱导了一些蜡质相关基因的表达，提高了苜蓿的抗旱性，同时转基因植株叶片的单位面积蜡质含量比野生型约高1/3。Seo等Q011)发现过量表达一个R2R3型MYB转录因子基因MYB96能够促进蜡质合成有关基因的表达，进而促进蜡质的合成，提高转基因拟南芥的抗旱性。因此，提高了作物叶片角质层的蜡质含量将有助于植物提高抗旱性。3-酮酰辅酶A合酶(3-ketoacyl-CoA synthase)是超长链脂肪酸(VLCFAs)碳链延长的限速酶，参与了角质层蜡质的生物合成。拟南芥3-酮酰辅酶A合酶基因CER6/CUT1 是延长CM超长链脂肪酸必需的。抑制CER6/CUT1基因导致转基因植株茎和角果的蜡质严重缺失和条件性雄性不育(Millar等，1999)。由此可见，提高3-酮酰辅酶A合酶的产量将有助于促进植株蜡质的积累进而提高植株的抗旱性。因此，本发明提出了利用3-酮酰辅酶 A合酶基因进行植物抗旱性基因工程改良的新方法。发明内容本发明的目的在于水稻Os⑶Tl基因的抗旱性基因工程应用。本发明的另一目的是提供含有Os⑶Tl基因的抗旱植物表达载体。本发明的目的可通过如下技术方案实现SEQ ID NO. 1所示的水稻3_酮酰辅酶A合酶基因Os⑶Tl的抗旱性基因工程应用。所述Os⑶Tl基因的抗旱性基因工程应用优选包括如下步骤1)水稻总RNA的提取；
2)水稻OsCUTl基因的克隆
以步骤1)获得的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，以序列如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示的上、下游引物进行PCR扩增获得具有完整编码区的水稻Os⑶Tl 基因的cDNA序列SEQ ID NO. 1 ；
3)植物表达载体的构建
以步骤2)中获得的PCR扩增产物为模板，以序列如SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 5所示的上、下游引物⑶TS1和⑶TS2经PCR扩增后，将Os⑶T1的cDNA克隆至中间载体 PMD18-T，进一步克隆到植物双元表达载体pCambia1300S从而获得插入Os⑶Tl基因的植物表达载体 pCambial300s-0sCUTl ；
4)转基因植株的获得
将步骤幻获得的表达载体pCambial300s-0s⑶Tl转入农杆菌，进一步转入水稻， 经PCR，Southern杂交或RT-PCR验证得到转OsCUTl基因的水稻。
一种含有SEQ ID NO. 1所示的水稻3_酮酰辅酶A合酶基因Os⑶Tl的抗旱植物表达载体。
利用本发明OsCUTl基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、WDiquitin启动子、Actin启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，对除草剂具有抗性的酶，也可利用颜色变化(例如葡糖醛酸糖苷酶GUQ或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类， 也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。
本发明的Os⑶Tl基因来自水稻，具有适合于水稻等单子叶植物表达的优化密码子，其基因工程受体植物除了双子叶植物，如烟草、大豆、棉花等之外更加适合于水稻、玉米、小麦等单子叶植物。
所述的抗旱植物表达载体优选将SEQ ID NO. 1所示的水稻3_酮酰辅酶A合酶基因Os⑶Tl克隆至植物双元表达载体pCambial300s的Kpn I和Xba I酶切位点间所得。
所述的抗旱植物表达载体在作物品种改良中的应用。
所述的抗旱植物表达载体在构建具有抗旱能力的转基因作物中的应用。
有益效果
1、本发明中克隆的水稻3-酮酰辅酶A合酶基因OsCUTl，为水稻中首次克隆的 3-酮酰辅酶A合酶基因。本发明公开了该基因的抗旱性基因工程应用。该基因来自水稻 (Oryza sativa L.)，可作为目的基因导入植物，提高植物抗旱性，以进行植物品种改良，所编码的蛋白质具有抗旱功能。
2、本发明人提供的OsCUTl基因功能是参与植物的抗旱应答反应，定量反转录聚合酶链式反应(Real-time RT-PCR)分析表明OsCUTl基因在和模拟干旱(20%PEG6000)和脱落酸(ABA)诱导条件下表达增强。


图1、Os⑶Tl基因提高转基因水稻的耐旱性。
(A)4叶期阳性转基因水稻植株(Si，S2，S3)和对照植株(WT)停止浇水8天后恢复供水，经恢复供水10天后存活率显著优于对照组的株系即为耐旱性增强的水稻转基因株系；(B)干旱处理后转基因株系和野生型株系的存活率统计。

实施例1
1)水稻总RNA的提取选用水稻品种“韭菜青”(太湖流域粳稻地方品种，为强耐盐品种)，待水稻幼苗长至3-4叶期后，用20% PEG6000或0. ImM ABA进行处理，1小时或 1 后立即取叶片置于液氮中冷冻保存。取部分叶片，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃勻浆器内。勻浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents, Invitrogen, USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
2)水稻Os⑶Tl基因的克隆以获得的总RNA为模板，按照美国Promega公司提供的反转录试剂盒的说明书进行反转录，合成cDNA第一链。
根据水稻Os⑶Tl基因的全长序列，设计两端引物上游引物 ATGCTGCTCCTCAAGGCC (SEQ ID NO. 2)；下游引物TTAGGCGATTTCGGGGAG (SEQ ID NO. 3)，采用 RT-PCR方法进行cDNA克隆。PCR扩增使用Primestar HS DNA聚合酶连同GC buffer扩增体系(Takara, Dalian, China)。PCR程序如下98°C预变性5分钟，98°C变性5s，M°C复性 10s，72°C延伸1. 5minJ8个循环后，72°C lOmin，将PCR产物加入普通Tag酶30min，克隆至 PMD18-T载体，测序后获得具有完整编码区的水稻3-酮酰辅酶A合酶基因Os⑶Tl的cDNA 序列 SEQ ID NO. 1。
OsCUTl全长1437bp，BioXM软件分析表明OsCUTl共编码478个氨基酸，使用BioXM 软件(版本2. 6)估算其等电点pi = 8. 16，分子量MW = 52. 29KDa。以OsCUTl搜索GenBank 中现有水稻基因组(包括粳稻和籼稻)数据库，发现OsCUTl为单拷贝基因。
实施例2
设计两对引物上游引物:GGTAGCCATCTCCTTCCTCA (SEQ ID NO. 6)，下游引物: CCTCTCTTCATCCTCCCCTT (SEQ ID NO. 7)，进行实时定量RT-PCR分析OsCUTl基因在水稻幼苗中的表达，以水稻actin基因Racl (McElroy et al,1990)的表达为内参。结果表明，3叶期的水稻幼苗转移至20% PEG6000溶液后Ih即显著增强，其表达量约为对照的10倍；类似的，3叶期水稻幼苗在0. ImM脱落酸ABA处理条件下，Os⑶Tl基因的表达在Ih处理后即表达量增加，1 时表达量达到最高，其表达量约为对照的12倍。该实施例表明该基因与植物的干旱胁迫密切相关。本发明的水稻Os⑶Tl基因为水稻中的首次报道，有望应用于植物尤其是单子叶植物的抗旱性遗传改良。
实施例3
根据水稻OsCUTl基因的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物上引入KpnI限制性内切酶位点，下游引物引入了 ^CbaI限制性内切酶位点上游引物CUTSl iAGGTACCATGCTGCTCCTCAAGGCC (SEQ ID NO. 4)，下游引物:CUTS2 ATCTAGATTAGGCGATTTCGGGGAG (SEQ ID NO. 5)，以实施例1中获得的PCR扩增产物为模板，经 PCR扩增后，将Os⑶Tl的cDNA克隆至中间载体pMD18_T，进一步克隆至植物双元表达载体 pCambia1300S的Kpn I和)(ba I酶切位点之间；将获得的表达载体转入农杆菌，进一步转入水稻，对获得的转基因植株进行使用PCR引物(SEQ ID N0. 6和SEQ ID N0. 7)进行RT-PCR 验证后进行植物的抗旱性评价，转基因植株的T3代和对照植株进行耐旱性分析。将经检测获得的4叶期阳性转基因水稻植株和对照植株停止浇水8天后恢复供水，经恢复供水10 天后存活率显著优于对照组的株系即为耐旱性增强的水稻转基因株系(图1)。经检测，恢复供水10天后，野生型水稻的存活率为对％，转基因株系的存活率则分别为100% (Si)，85.7% (S2)以及100% 6；3)(图1)。本实施例表明该基因与过量表达后能够提高转基因植株抗旱性，适合于水稻、玉米、小麦等作物的抗旱性遗传改良。


本发明属于基因工程领域，涉及水稻OsCUT1基因的抗旱性基因工程应用。OsCUT1基因序列如SEQ ID NO.1所示，该基因来自水稻(Oryza sativa L.)，编码水稻超长链脂肪酸碳链延长的限速酶3-酮酰辅酶A合酶，参与了角质层蜡质的生物合成。mRNA表达分析表明该基因受脱落酸和干旱胁迫的显著诱导。通过总RNA的提取、OsCUT1基因的克隆、植物表达载体的构建以及水稻转基因研究，获得了耐旱性显著增强的转基因水稻株系。OsCUT1基因可作为目的基因导入植物，显著提高转基因植物的抗旱性。