专利名称：一种橡胶树多酚氧化酶、其编码基因及应用的制作方法多酹氧化酶(Polyphenol Oxidase, PP0)是一类广泛分布于动物、植物、真菌和细菌中的含铜氧化还原酶。在O2存在下，PPO可催化单酚羟基化为邻二酚，二羟酚氧化为邻醌。广义的PPO包含漆酶(laccase, EC. I. 10. 3. I)、酪氨酸酶(tyrosinase,或单酹氧化酶，monophenolase, EC. I. 14. 18. I)和儿茶酌■氧化酶(catechol oxidse,或双酌■氧化酶，o-diphenoloxidase, EC. I. 10. 3. 2)。一般所说的PPO是指儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。儿茶酚氧化酶是植物中主要存在的PP0，它由核基因编码，大多植物中以多个基因家族形式存在。PPO通常以无活性的前体形式存在，该前体一般由N-端导肽(transit peptide)、中间高度保守的Cu结合区及C-端疏水区组成。导肽具有叶绿体定位蛋白的典型特征，它可引导PPO前体蛋白定位到叶绿体的类囊体和其它类型质体的基质中。Cu结合区是功能区，该区域6-7个高度保守的组氨酸(His)和I个半胱氨酸(Cys)残基对于其酶活性是必需的。晶体结构显示，两组His残基(每组3-4个)分别可与一个Cu以配位键形式相连，从而形成具有特定三维结构(Type-3 copper bridged)的活性部位。疏水性的C-端只在前体中存在，常由几个￠-链形成反向平行的￠-折叠，它可与Cu结合，可能与PPO三维结构的形成及酶活性有关。PPO基因的表达特性比较复杂，不同家族成员在不同组织、不同发育时期及不同环境条件下呈现出不同表达模式，并且不同成员的底物特异性明显不同。PPO基因可被机械损伤、病原物侵染、植食性昆虫取食为害、虫害诱导挥发物及茉莉酸、水杨酸等防御反应信号分子处理诱导。除参与植物病原物侵染及虫害等防御反应外，PPO是水果、蔬菜等农产品发生有害褐变的主要原因。天然橡胶(顺-1，4-聚异戊二烯)是一种重要的工业原料，其主要来源为巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell. Arg.)。橡胶树中，除胶乳中存在PPO夕卜(CoupeM, Pujarniscle S， d’ Auzac J. Compartimentation de diverses oxydo-reductases(peroxydase, o-dipheno1-oxydase et malate deshydrogenase) dans Ie latex d’Heveabrasiliensis (Kunth). Miill Arg Physiologie Vegetale, 1972, 10: 459 - 464;Wititsuwannakul D, Chareonthiphakorn N, Pace M, Wititsuwannakul R. Polyphenoloxidases from latex of Hevea brasiliensis: purification and characterization.Phytochemistry, 2002, 61 (2) : 115-121)，橡胶树的芽、叶片、种子和悬浮细胞均具有PPO活性。据最近的报道，橡胶树的愈伤和悬浮细胞中存在2种PPO蛋白(这里我们将其命名为HbPPOl和HbPP02)，其中HbPPOl受损伤抑制，而HbPP02则为损伤所诱导，这表明HbPP02可能了参与橡胶树的防御反应，同时也可能是造成橡胶树组培外植体褐化的主要原因。深入研究发现，HbPP02的分子量约为70 kDa，酸性蛋白，最优底物为儿茶酚(MuhamadN， Chirapongsatonkul N， Churngchow N. Defense-Related Polyphenol Oxidase fromHevea brasiliensis Cell Suspension: Purification and Characterization. ApplBiochem Biotechnol, 2012, 167(1) : 177-189)。虽然如此，然而至今还未见有关该酶编码基因及其蛋白序列的报道。
本发明的目的在于提供一种受损伤诱导的橡胶树多酚氧化酶、其编码基因及应用。本发明提供的多酚氧化酶，最初来自于大戟科橡胶树属巴西橡胶树(Heveabrasiliensis Muell. Arg.),名称为 HbPP02,是如下(I)或(2)的蛋白质(I)由序列表中SEQ ID NO: 2的氨基酸序列组成的蛋白质，其分子量为67 kDa,等电点为6. 66，带电荷数为-0.41，酸性蛋白； (2)由序列表中SEQ ID NO: 2的序列经过一个或几个氨基酸残基的替代和/或插入和/或缺失且具有多酚氧化酶活性的衍生蛋白质。序列表中SEQ ID NO: 2的序列由592个氨基酸残基组成。所述一个或几个氨基酸残基的替代和/或插入和/或缺失是指不超过10个氨基酸残基的替代和/或插入和/或缺失。上述(I)中的HbPP02可从巴西橡胶树的芽、叶片、种子、愈伤及悬浮细胞等组织或细胞中分离、纯化，优先推荐采用抽滤处理后的悬浮细胞；同时也可以从利用HbPP02的编码基因获得的转基因材料中分离、纯化。上述(2)中的HbPP02可人工合成，也可以先合成其编码基因，再进行生物表达得到；所述的编码基因是指通过一个或几个碱基的替代和/或插入和/或缺失获得的且其编码蛋白质具有多酚氧化酶活性的衍生基因。所述HbPP02的编码基因也属于本发明的保护范围。所述HbPP02的编码基因为如下⑴、⑵或(3)的核苷酸序列(I)序列表中SEQ ID NO: I的核苷酸序列；(2)由序列表中SEQ ID NO: I的核苷酸序列经过一个或几个碱基对的替代和/或插入和/或缺失而获得且其编码蛋白质具有多酚氧化酶活性的衍生基因；(3)基因编码区序列与序列表中SEQ ID NO: I的核苷酸序列的相似性在90%以上且其编码蛋白质具有多酚氧化酶活性的基因。 序列表中SEQ ID NO: I由1869个核苷酸组成。含有所述多酚氧化酶编码基因的表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植株或转基因重组菌均属本发明的保护范围。本发明的HbPP02具有多酚氧化酶活性，其底物至少包括儿茶酚(catechol)和多巴胺(dopamine)，其中以儿茶酚为优；该酶在pH 4. 0-10. 0及温度10-60°C之间具有较高的活性，其中以pH 6. 0为优；该酶的活性可以被0. 5 mmol/L的抗坏血酸(ascorbic acid,ASA 或维生素 C，Vitamin C，Vc) >0. 5 mmol/L 的二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT)或I. 0 mmol/L的0 -巯基乙醇(0 -mercaptoethanol, ^ -ME)完全抑制；该酶至少存在于芽、叶片、种子、愈伤及悬浮细胞中，且蛋白水平至少受病原物侵染和机械损伤所诱导。该酶或经过一个或几个氨基酸残基的替代和/或插入和/或缺失且具有多酚氧化酶活性的衍生蛋白至少可用于食品和工业领域中漂白或氧化有色物质；利用该基因的部分或全部序列反义表达至少可抑制橡胶树组培中的褐化现象；利用该基因或经过一个或几个碱基对的替代和/或插入和/或缺失而获得的功能性衍生基因过量表达至少可提高橡胶树的抗病虫能力。mRNA 的分离纯化优先推荐 PolyATtract mRNA isolation System III withMagnetic Stand (Promega),具体操作详见试剂盒说明书。cDNA第一条链的合成优先推荐PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)，具体操作详见试剂盒说明书。以合成的cDNA为模板，采用兼并引物进行PCR扩增，反应体系如下lyL模板cDNA, 5 u L 10XPCR buffer, 4. 5 u L 25 mmol/L MgS04，4.5 u L 2mmol/L dNTP,0. 2 u L25 u mol/L HbPP0F,0. 2 u L 25 uM HbPPOR, I. 0 u L I u/u L LA Taq (TaKaRa)JpddH2O至50 y L ;优先推荐用Eppendorf 5331 PCR仪进行PCR反应，反应条件如下94°C预变性 3 min，然后94°C 30s,55°C 30 s，65°C 30 s，25个循环，再68°C延伸 5 min。吸取 2. 5 u LPCR产物与2. 5 ii L溴酚蓝混匀后用I. 5%琼脂糖凝胶进行电泳后，经溴化乙锭(EB)染色，发现500 bp处有明亮的清晰条带，挖胶回收后克隆到TA载体，胶回收优先推荐MinEluteGel Extraction Kit (Qiagen), TA 载体优先推荐 pMD 20-T (TaKaRa),经蓝白斑筛选和菌落PCR验证后委托北京三博远志生物有限责任公司进行序列测定，测序结果表明获得2条近466 bp的差异的基因片段，其中一条与前期在胶乳中克隆到的HbPPOl序列一致，对应于悬浮细胞中受机械损伤抑制的ffiPPOl ;另一条为未知序列，命名为HbPP02，推测对应于对应于悬浮细胞中受机械损伤诱导的HbPP02。HbPP02 5’及3’端序列的克隆根据上述获得的保守序列分别设计3’ RACE外侧引物 HbPP02Fl (5，TGC GAT TGC CAG CTC TAT ATG C 3’)和 3’ RACE 内侧引物 HbPP02F2(5，AGC TCA ACT ATC TAG CAA TCT TAC C 3’)以及 5’ RACE 外侧引物 HbPP02Rl (5，TTCGAT CAA CGT TAG AGT GAT GAG 3’)和 5’ RACE 内侧引物 HbPP02R2 (5，ATG TTC TCA ATAGAA CCA GCA CC 3’)，RACE 试剂盒优先推荐 5’-Full RACE Kit 和 3’-Full RACE CoreSet Ver. 2. 0 (TaKaRa)，具体操作详见试剂盒说明书，PCR反应、产物克隆及测序与上述保守序列的获得类似。这样，通过5’ RACE我们获得一条近I kb的序列，通过3’ RACE我们也获得一条近I kb ;通过拼接，我们得到一条1869 bp、包含完整读码框(长1779 bp)的核苷酸序列。HbPP02全长cDNA及基因序列的克隆根据上述拼接得到的核苷酸序列设计引物HbPP02F (5，AAC CAA ATC ATG GGT TCT TTT TGT CCT TC 3，)和HbPP02R (5，TGC TCA AGATCA TCA ATC TTG CAC AAA G 3，)，分别以基因组DNA和合成的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应、产物克隆及测序与上述保守序列的获得类似。这样，我们从基因组DNA和合成的cDNA模板都得到I条1800 bp的核苷酸序列，两条序列一致，这表明该基因无内含子，正式将其命名为HbPP02。HbPP02基因与悬浮细胞来源HbPP02蛋白的对应关系的进一步证实虽然我们通过采用特异的材料一悬浮细胞分离ffiPP02基因和HbPP02蛋白，并通过测定分子量和等电点初步证实HbPP02 基因就是悬浮细胞来源的酸性PPO蛋白的编码基因，但我们还是很难排除橡胶树中还存在与ffiPP02高度同源的蛋白质。为此，我们充分利用了我所测定的橡胶树的基因组序列(未公布)，通过基因组范围内的搜索，我们找到5个其预测的编码蛋白中包含Tyrosinase [pfam00264]结构域的基因序列，而这些基因中仅有一个基因编码一酸性蛋白，其序列与ffiPP02基因一致。这样，我们正式确认上述分离的HbPP02基因就是上述HbPP02蛋白的编码基因。本发明公开了一种橡胶树多酚氧化酶、其编码基因及应用。该基因无内含子，其cDNA序列长度约为1869 bp，具有序列表中SEQ ID NO: 1的序列，命名为HbPPO2。HbPPO2编码592个氨基酸，具有序列表中SEQ ID NO: 2的序列，其分子量为67 kDa，等电点为6.66，带电荷数为-0.41，酸性蛋白；该酶至少存在于芽、叶片、种子、愈伤及悬浮细胞中，且蛋白水平至少受病原物侵染和机械损伤所诱导。该酶或其衍生蛋白至少可用于食品和工业领域中漂白或氧化有色物质；利用该基因的部分或全部序列反义表达至少可抑制橡胶树组培中的褐化现象；利用该基因所获得的功能性衍生基因过量表达至少可提高橡胶树的抗病虫能力。