调控哺乳动物毛色表型的载体及其应用制作方法_于秀菊专利（表型,毛色,载体）-早鸽网

调控哺乳动物毛色表型的载体及其应用制作方法

专利名称

调控哺乳动物毛色表型的载体及其应用制作方法
发明者

于秀菊, 王海东, 田雪, 耿建军, 范瑞文, 董常生, 贺俊平, 赫晓燕
公开日

2012年8月1日
申请日期

2012年3月12日
优先权日

2012年3月12日
申请人

山西农业大学
文档编号

A01K67/027GK102618576SQ20121006241
关键字

表型毛色载体哺乳动物调控
权利要求

1.一种载体，其序列中包括3个串联的pre-mir-137基因序列2.根据权利要求I所属的载体，所述的载体含有SEQNO 1的序列3.含有权利要求I或2所述的载体的试剂盒，所述的试剂盒包括转染试剂和缓冲溶液4.权利要求I或2所述的载体在调控黑色素细胞中黑色素的表达中的应用，所述的黑色素细胞可以是离体细胞，也可以是哺乳动物体内的黑色素细胞，所述的调控优选是下调黑色素的表达5.根据权利要求4所属的应用，所述的调控是通过调节黑色素细胞中MITF的表达进行调控6.权利要求I或2所述的载体在调控MITF的表达中的应用7.一种调节哺乳动物毛色表型的方法，其特征在于将权利要求I或2所述的载体制成注射液，然后通过显微注射的方式转入到哺乳动物的胚胎中，生长发肓产生哺乳动物8.根据权利要求7所述的方法，所述的哺乳动物优选是小鼠
技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种哺乳动物毛色表型的调控方法，更具体涉及含有miR-137基因的调控哺乳动物毛色表型的载体及其应用
背景技术
具体实施例方式

I. mir-137在原代黑色素细胞系转染为了证明mir-137和MITF及其下游基因是否存在相互影响的关系，通过分子生物学的常规方法使用质粒PcDNA 6. 2-GW/EmGFPmiR、pre-mir-137,和报告基因构建了pre-mir-137 表达载体，并在 pcDNA 6. 2-GW/EmGFPmiR 上串联了 3 个 pre-mir-137我们设计了原代黑色素细胞阴性对照组，空载组和实验组，在对数生长期分别进行转染，结果发现阴性对照组和空载组MITF及其下游基因无明显变化，实验组miR-137被极显著的提高，如图I所示经统计，达到对照组的17倍，而MITFmRNA没有显著变化，对所转染细胞进行蛋白抽提后，western bolt结果显示MITF蛋白量明显下降,仅为对照组的1/2对调控的黑色素合成路径上MITF下游基因进行检测发现TYR、TYP1和TYRP2均出现显著下降，如图2所示结果显示，miR-137的高表达通过MITF间接调控了黑色素合成路径上黑色素合成关键酶的转录，影响黑色素细胞合成黑色素的量，从而影响毛色表型变化为了近一步验证miR-137表达量与色素合成量之间的关系，我们对黑色素细胞设计了 3个不同剂量的实验组同时进行转染，结果显示，高转染组miR-137表达量分别为中转染组和低转染组miR-137表达量的A倍，B倍，MITF和其下游基因进行检测发现均出现不同程度的变化，黑色素合成量miR-137高转染组明显要少于中转染组和低转染组，暗示了miR-137的表达量和黑色素细胞合成黑色素的量存在相关性，这种相关性可能与动物毛色表型变化有着内在的联系2. Mir-137转基因小鼠毛色表型为了探索mir-137对活体动物毛色变化是否具有调控作用，采用转基因原核注射法将上述含有串联pre-mir-137基因序列的表达载体(5ng/μ 1，饱和剂量注射)注射到小鼠胚胎，生长发肓产生小鼠，并进行繁殖传代转基因后共获得五个转基因品系，185只Fl代小鼠，PCR确定其基因型，对Fl代mir-137阳性小鼠进行了实验对转基因小鼠与野生型小鼠繁殖率和存活率进行比较，显示没有明显差异为了分析转基因表达是否影响了色素生成和毛色表型，肉眼观察，转基因小鼠中45只小鼠被毛呈现了灰色，7只小鼠被毛呈现棕黑色，其他68只仍为黑色(图3展示了部分典型照片)同时，我们采用分光光度法对所有实验小鼠被毛黑色素(可溶性黑色素)含量进行了提取测定，结果说明，所有mir-137转基因小鼠被毛中的黑色素含量均有不同程度的减少3. Mir-137转基因小鼠皮肤中毛色基因的表达为了揭示mir-137转基因小鼠被毛表型发生变化的内在因素，首先使用定量PCR对miR-137转基因小鼠皮肤miR-137和M ITF表达量进行了检测，结果显示miR-137转基因小鼠miR-137表达量显著高于野生型小鼠，而MITFmRNA表达量与野生型小鼠无明显差异使用基因芯片对miR-137转基因鼠和野生型鼠皮肤差异表达基因进行了筛选，同时，使用定量PCR对小鼠皮肤差异表达基因进行了检测发现多个基因存在差异表达，其中TYR、TYRPl和TYRP2与毛色有关的基因表达差异显著，而其中仅有MITF为miR-137的目标基因，这些与毛色有关基因存在于a-MSH/MC1R( a-melanocyte stimulating hormone/melanocortin 1-receptor)通路上免疫组化和Western bolt结果显示具有活性黑色素细胞数量明显减少，MITF蛋白量显著下降，并检测了色素生成路径上MITF调节的酶TYR、TYRPl和TYRP2，均出现不同程度的表达减少MiR-137的过量表达通过MITF间接影响到了黑色素细胞的分化成熟，干扰了色素合成路径，导致色素合成减少，从而使毛色由深变浅通过本发明的实施例，证明了单一 miR-137的重要作用MiR-137转基因小鼠显示了 miR-137可以调节毛色表型的变化，提供了一种调控毛色表型的新途径分子机制分析可见，miR-137可以转录后下调MITF的表达，从而降低TYR，TYPl，TYRP2等的转录，进而温和的调控了小鼠皮肤和被毛的黑色素合成应当理解的是，上述

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法律状态

专利名称：调控哺乳动物毛色表型的载体及其应用的制作方法在毛纺行业中毛色是被毛最重要的经济性状之一，越来越多得受到了人们的关注，而且对毛色的调控必将在毛纺染色行业产生深远意义。被毛的颜色主要取决于沉着于皮肤、毛球等处的黑色素合成、运输和分布情况。在细胞水平，黑色素细胞合成黑色素，其位于表皮的底层，并且有规律的穿插在角质化细胞间。分泌的黑色素包含体被称为黑素体，运输出黑素细胞进入邻近的角质化细胞，在那里可以发现大量的黑色素。众所周知，色素沉着的差异变化由引起的黑素体数量、大小、组成以及与在角质化细胞中的分布有关。虽然已知有些因素，例如α-MSH，MClR和MITF等影响产生黑色素，但决定被毛颜色的黑色素生成的分子机制过于复杂，仍然没有研究清楚。现在毛色改变主要集中在毛色形成路径上基因的突变导致，但这种变化是一种剧烈的，病态的变化，如白化病和白癜风的发生等，并不能得到真正意义上的人为毛色控制。哺乳动物毛色表型的控制到目前为止没有有效的方法进行人为控制，即便利用长期育种的方法改良被毛性状，也会是一种单一的表型变化且此法耗时、费钱、效果甚微，具有较高的不确定性。
本发明针对现有哺乳动物毛色表型的控制的不足之处，提供一种新的调控方法，为了实现本发明的目的，拟采用如下的技术方案一种载体，其序列中包括3个串联的pre-mir-137基因序列。在本发明的一个优选实施方式中，所述的载体含有SEQ NO I的序列。本发明另一方面还涉及含有上述载体的试剂盒，所述的试剂盒包括转染试剂和缓冲溶液。本发明另一方面还涉及上述载体在调控黑色素细胞中黑色素的表达中的应用，所述的黑色素细胞可以是离体细胞，也可以是动物体内的黑色素细胞，所述的调控优选是下调黑色素的表达。在本发明的一个优选实施方式中，所述的调控是通过调节黑色素细胞中MITF的表达进行调控。本发明另外一方面还涉及上述载体在调控MITF的表达中的应用。本发明另一方面还涉及一种调节哺乳动物毛色表型的方法，其特征在于将上述载体制成注射液，然后通过显微注射的方式转入到哺乳动物的胚胎中，生长发肓产生哺乳动物。在本发明的一个优选实施方式中，所述的哺乳动物优选是小鼠。本发明的载体转染效率闻，能够实现并极大的提闻调节哺乳动物毛色表型的几率，动物表型变化明显但又控在人为控制范畴之内，是一种较为缓和而有效的调控模式，能够在产业上大范围使用，具有良好的市场前景。在本发明中，miR-137是指microRNA_137,其序列是现有技术已知的；Pre-miR-137是指miR-137的前体序列，其序列为SEQ NO 2或3，两者为互补序列；MITF 是指 Micropthalmia-associated transcription factor (小眼畸形相关转录因子)。图I :MiR_137高效转染小鼠原代黑色素细胞系；图2 :MiR-137转基因小鼠MITF，TYR，TYRP-1和TYRP-2表达发生表化.(D)转基因小鼠MITF，TYR. TYRP-I, TYRP2蛋白表达发生改变.(E)转基因小鼠和野生型小鼠miR-137表达水平比较结果(F) (G) (H) (I)转基因小鼠 MITF，TYR. TYRP-I, TYRP2 Real-time PCR 结果;图3 :典型的miR-137转基因小鼠和野生型小鼠毛色表型比较。
仅是例举性说明，而不是对本发明的限制，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

本发明公开了一种含有mir-137基因前体序列的载体及其调控哺乳动物毛色表型中的应用。本发明的载体转染效率高，能够实现并极大的提高调节哺乳动物毛色表型的几率，动物表型变化明显但又控在人为控制范畴之内，是一种较为缓和而有效的调控模式，能够在产业上大范围使用，具有良好的市场前景。

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