生产抗哺乳动物病毒标记疫苗的方法

思塔尔·雷勒, 莱尔森萨尔茨·贝尔格特, 沃尔夫·诺伯特

2003年6月11日

2002年9月18日

2001年9月18日

马尔塔根研究股份有限公司

C12N15/33GK1422665SQ0213176

哺乳动物 标记 病毒 疫苗 生产

1.一种生产抗哺乳动物病毒标记疫苗的方法，其特征在于从谷类植物或其组织产出此疫苗的免疫蛋白2.根据权利要求1所述的一种生产抗哺乳动物病毒标记疫苗的方法，其特征在于所述植物可表达一系列基因，这些基因可编码哺乳动物蛋白的部分而不是全部免疫蛋白3.根据权利要求1或2所述的一种生产抗哺乳动物病毒标记疫苗的方法，其特征在于所述植物为谷类植物中的大麦、小麦、黑麦、麦粒、稻谷和玉米4.根据权利要求1至3之一所述的一种生产抗哺乳动物病毒标记疫苗的方法，其特征在于所述哺乳动物病毒源于致病病毒5.根据权利要求1至4之一所述的一种生产抗哺乳动物病毒标记疫苗的方法，其特征在于所述病毒为经典猪热病毒，边疆病病毒和牛病毒性腹泻病毒6.根据权利要求1至5之一所述的一种生产抗哺乳动物病毒标记疫苗的方法，其特征在于所述免疫蛋白为经典猪热病毒或其衍生物的E2基因和/或Erns基因编码的基因产物7.根据权利要求1至6之一所述的一种生产抗哺乳动物病毒标记疫苗的方法，其特征在于谷类植物基因被密码子优化8.一种转基因植物或其组织部分，其特征在于均含有至少一个编码哺乳动物病毒免疫蛋白基因9.根据权利要求8所述的一种转基因植物，其特征在于含有一系列编码哺乳动物病毒的部分免疫蛋白的基因10.根据权利要求8或9所述的一种转基因植物，其特征在于该转基因植物为大麦、小麦、黑麦、麦粒、稻谷和玉米11.根据权利要求8至10之一所述的一种转基因植物，其特征在于所述哺乳动物病毒为致病病毒12.根据权利要求11所述的一种转基因植物，其特征在于所述哺乳动物病毒为经典猪热病毒，边疆病病毒和病毒性腹泻病毒13.根据权利要求8至12之一所述的一种转基因植物，其特征在于该转基因植物产生的免疫蛋白为经典猪热病毒或其衍生物的E2基因和/或Erns基因的基因产物14.根据权利要求13所述的一种转基因植物，其特征在于该转基因植物的基因为谷类植物密码子优化基因15.根据权利要求8至14之一所述的一种转基因植物，其特征在于该转基因植物的基因表达于谷类植物的谷粒中16.根据权利要求8至15之一所述的谷类植物或组织部分制成的动物的食物或饲料17.根据权利要求1至7之一所述方法制成的标记疫苗或权利要求16所述的用于免疫哺乳动物，尤其是猪类的动物饲料的用途18.根据权利要求17所述的用途，其特征在于该标记疫苗能够口服

本发明涉及一种生产抗哺乳动物病毒标记疫苗以及培育产出含此疫苗成份的转基因谷类植物或其部分组织的方法然而，CSFV不仅导致家养猪发病，亦可导致野生猪发病从九十年代早期开始野生猪就开始受到此病的侵袭，发病率有上升趋势在这几年中，感染有CSFV病毒的野生猪被认为是家养猪感染此病毒的一个重要传染源从1993年到1999年间，家养猪中发病的55％左右被认为与直接或间接接触的已感染此病毒的野生猪类有关因此，与感染CSFV病毒的野生猪做斗争对于消灭家养猪的此病毒感染是非常必要的保证我们饲养的牲畜有一持久的健康保护(最后能获得商业利益，当然这不是唯一目的)以及消灭兽疫的流行就要寄希望于兽医和农业了因此，可用于预防或在流行情况下可防止或减少感染性疾病危害性的兽类疫苗对于农民和兽医来说就显得尤为重要抗CSFV的活疫苗，在1992年被禁止使用以前曾用于主动免疫家养猪类，对减小欧洲国家此病流行范围和防止农业上的重大经济损失有所帮助然而，随着市场的国际化，政府中止了此疫苗的使用，从而使得活的牲畜和肉产品在欧盟国家内部和外部可进行非限制性流通此现象的原因为注射过疫苗的动物和病毒携带动物无法用血清学方法进行辨别去年，一代新的疫苗产品(也称为标记疫苗)被允许生产，此产品可免疫家养猪类，防止CSFV的感染，此疫苗的制备方法为由杆状病毒表达系统(EP-A-O 924298)产出重组病毒蛋白动物感染致病病毒后会产生三种抗体抗Erns抗体(AB)，抗E2抗体(二个包膜抗体)和抗NS3(一种血清蛋白酶)的抗体，其中仅有抗E2的抗体具有强大的中和病毒的能力应用标记疫苗以后，猪类仅仅产生抗包膜蛋白的抗体，通过特殊检测方法就有可能分辨注射过疫苗的猪和感染了病毒的猪生产和应用此疫苗(每只猪必须进行两次疫苗注射)要花费大量的时间、人力和财力另外，此疫苗不能口服，故不能用于野生猪而此发明是在生产标记疫苗的另一种方法的技术基础而创造出来的，本发明克服了上述方法的不利之处，它所依赖的技术基础为纠正上述方法的不利之处提供途径此方法通过生产抗哺乳动物病毒的标记疫苗而纠正了上述方法的缺点此哺乳动物病毒疫苗的免疫蛋白是由谷类植物或其部分组织产出的通过培育一种转基因谷类植物(或为其部分组织)米解决上述问题，其内至少有一种基因编码哺乳动物病毒的免疫蛋白近几年中，转基因植物的异种产物，特别是异种多肽的生产显示了其重要性在转基因植物中，通过调节植物代谢后可据目的不同而使其内特殊蛋白的表达量上调或下调，另外还可直接构建转基因植物，以生产原米并不存在于植物中的异种产物，如细菌毒素、人类蛋白或生物制品“标记疫苗”一词是指此疫苗有别于由于真正病原体而产生的对抗此微生物的疫苗一般来说就是标记疫苗可使机体产生一种不同于真正病原体所产生的抗体故基于获得免疫的机理不同，人们就能够辨别某动物的抗体是由标记疫苗免疫还是为受自然病原体感染所致在此发明中，“谷类植物”为携带基因信息的一种植物，由于经过基因型改装后可以编码至少一种免疫蛋白(或至少为蛋白的免疫组份)，它为抗哺乳病毒的组份，故可免疫哺乳动物此谷类植物可表达此免疫蛋白，如果需要的话，可仅在导入调节表达免疫蛋白的启动子后再进行表达另外，免疫蛋白可仅在谷类植物的“部分组织”中表达此情况通常为编码此免疫蛋白的基因受控于组织特异性启动子谷类植物的“组织部分”可为种子，叶子或谷类植物的组织培养物等为达到理想目的，植物内必须存在一系列基因，这些基因可编码哺乳动物病毒的免疫蛋白(精确的说则是免疫表位)的部分肽链，而不是编码病毒所有的免疫蛋白(表位)这样，受标记疫苗免疫的生物可产生一种不同于被自然病原体感染后所产生的抗体此标记疫苗亦可通过加入免疫原组份修饰后而导致机体产生不同于自然病原体所致的免疫反应此类被添加的免疫组份可为不存在于自然病原体中的蛋白，当其被加入到标记疫苗中后，可使被免疫的生物产生的抗体不同于受自然病原体感染的生物所产生的抗体这样一种蛋白质(或称免疫表位)能以与真正的免疫蛋白融合的形式而存在此疫苗另一优点为制备疫苗的谷类植物为大麦、小麦、黑麦、麦粒、稻谷或玉米，其中有特别适合喂养动物的谷类，如小麦，大麦和玉米其还有一优点为标记疫苗可预防此(猪热病毒)病毒家族中所有的病毒的感染，此免疫包括了特别是对经典猪热病毒，边疆病病毒和牛病毒性腹泻病毒的免疫其又一优点为此免疫蛋白是经典猪热病毒的E2基大和Erns基因的基因产物中一种，也可为上述基因产物的衍生物，能够使机体产生抵抗上述病毒的足量的免疫力衍生物可为蛋白全长的一部分，但至少存在数个免疫表位衍生物亦可为E2或Erns基因产物与另一蛋白的融合蛋白，这另一蛋白即为前述的“标记”衍生物还可为上述蛋白产物的突变体，使其能产生最佳免疫效能或使其在谷类植物中的稳定性得到提高其另一优点为基因的密码子被优化，故而使谷类植物中标记疫苗的产出亦得到优化这使得谷类植物中的目的蛋白能得到最大量的表达植物中标记疫苗的免疫蛋白的产量与其免疫能力有着同等重要性其还有一优点为免疫蛋白仅在植物的部分组织中表达，如种子这样，启动子在植物发芽或播种时才具有相当的活性这种表达系统在US 5,693,506和WO 97/32986中描述过此方法使得免疫蛋白不仅可在活体植物中得到，亦可在未种入土地中仅在一封闭盒中生芽的种子中获得这被称为麦芽技术，与可控环境下的植物出芽有关一般来说，此技术主要应用于啤酒的生产，包括如植物种子的浸渍，可控环境下的种子出芽等步骤在可控环境中，一些如湿度、温度、盐浓度和植物的震荡频度等参数可由人为因素控制此技术在“Die Biebrauerei”，卷一，“DieTechnologies der Malzzubereitung”，FerdinandEnke-Verlag Stuttgart(1999)中有所叙述此发明中转基因谷类植物或植物的部分组织中至少有一个编码哺乳动物病毒免疫蛋白的基因，此基因被称为转导基因这种“转基因植物组织”是一种含有转基因宿主细胞的植物组织，这种转基因宿主细胞中至少有一种转基因核酸分子已经稳定的整合到宿主基因组中，这种核酸分子或者对于植物来说是异种的，或者是不存在于宿主细胞小的，或者虽对于植物是同种物质，但与野生型细胞的基因型是不相同的此发明还有一优点为转基因植物中一系列基因可编码哺乳动物病毒的免疫蛋白部分免疫表位其意义为此种植物不会表达病原体的全部免疫表位，而仅仪表达其中的一部分，故而由此产生的免疫反应抗体就不同于自然界病原体感染后所产生的免疫反应抗体根据两种产生的抗体不同，可对其进行辨别此发明另一优点为植物可从大麦、小麦、黑麦、麦粒、稻谷和玉米中选取植物中所含的基因能编码致病病毒的免疫蛋白其另一优点为在转基因植物中表达的基因能编码经典猪热蛋白，边疆病病毒和牛病毒性腹泻病毒中之一的免疫蛋白编码上述病毒表面蛋白的基因对于专家来说是熟悉并易于获得的在转基因植物中最理想的表达基因为经典猪热病毒的E2和Erns基因，可通过目的基因变异手段对基因进行修饰后使植物中能产出自然基因产物的衍生物此过程对于提高基因产物的稳定性和免疫原性是有帮助的为了在植物中获得目的产物的高表达产量，有必要对基因编码区进行修饰以期使其在植物中有最高表达量对于专业技术人员来说，这些编码区修饰工作是了熟于胸的此发明还有一优点为目的基因产物尤其能在谷类植物的谷粒中表达如果应用适当的活化的启动子(如形成麦芽时的启动子)，则可通过导入特定启动子后而在特定时间内获得目的基因产物此外，本发明正如前所述，其内容物为谷类植物或植物组织，可制成动物的饲料或食物通过饲养途径，就可刺激免疫系统产生对抗相应病毒的免疫反应此种饲养动物而产生免疫反应的方法比目前通过注射疫苗来免疫动物的经典方法具有绝对的优势，因为对于非家养动物的免疫来说饲养动物无疑要简单的多而且实施可行性更大表达的免疫结构蛋白由致病病毒蛋白衍生而来，这些致病病毒包括经典猪热病毒(CSFV)，边疆病病毒(BDV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)致病病毒基因组转录约12.5kb长的单链RNA，其上有一开放阅读框架，可编码约含4000个氨基酸的蛋白质此蛋白质在翻译时和翻译后都可通过细胞和病毒蛋白酶进行修饰病毒结构蛋白中的包膜蛋白E2，Erns和E1位于此蛋白的N端原始或合成基因均可通过修饰手段而提高基因产物产量或增加表达产物在植物组织中的稳定性改变基因序列的方法称为直接基因诱导，如改装外显子以及其它类似的工作理想的蛋白质结构为编码嵌合基因产物的基因编码区5’端有一个单瓦松植物(monocotyledonic)的启动子此启动子可为大麦的D-大麦醇溶蛋白启动子(SEQ ID号3)和淀粉酶启动子(SEQ ID号4)，它们在Wittler R.F.et.al(1987)中有所描述对d-淀粉酶和巯基蛋白酶基因的核苷酸序列分析可在大麦麦粉蛋白细胞中以激素进行调控这在Nacl.Acid Res.15，2515-2535和Sorensen M.B等(1996)中描述野生型和变异型的大麦醇溶蛋白启动子的甲基化后的转录活性在Mol.Gen.Genet.250.750-60中描述另外，嵌合基因还包括植物和细菌基因中位于启动子和编码区之间的5’端未翻译区(5’-UTR)和3’端未翻译区(3’-UTR)理想的3’-UTR为末端终止序列此序列包含5’端多聚腺苷酸化的非编码区，编码区和转录终止序列在Jensen L.G.et，al(1998)中描述过遗传有密码子优化基因的植物能表达黄痂癣真菌的热稳定(1，3-1，4)-β-葡聚糖和出芽的大麦中麦粉蛋白粒(Herditas 129215-225)2.植物转化植物转化的基本工作为将此发明的嵌合基因导入植物载体中载体可为允许DNA从细菌转入植物中的质粒或病毒这些植物的表达载体在US 5,693,506中有叙述A.转化载体除开上述的嵌合基因，此发明亦需要载体上有应用于植物细胞中的选择标记基因，如丁胺卡那霉素抗性基因或phosphinotricin乙酰基转移酶基因，以及允许在第二宿主中进行选择和生长的序列，如酵母菌和细菌另外，用于此目的的载体含有与土壤杆菌肿胀载体同源的序列此发明中在T-DNA边界区序列特别具有同源性以被称为双面载体来进行实验，它允许必要的“选择基因”从目的基因上分离下来(by outcrossing)这对于此发明中蛋白质能被口服这一特性显得尤重要在这种双面载体中，选择基因(如杆状基因)和上述的嵌合基因通过单独的T-DNA边界序列进行侧侧相接，这样就能在植物基因组中形成独立的重组基因产物B.植物细胞的转化植物组织的转化部分在US 5,693,506或WO 9,836，085中有叙述从未成熟的种子中选出胚种，经过48小时孵育后，与转基因后的土壤杆菌共同培养之后还需进行数次洗涤和在暗处和亮处交替孵育的处理经过相应的选择步骤后，就可对被选择的植物进行培育了异种蛋白的表达率在未成熟和成熟的谷物中可被检测到3.免疫动物免疫一般在家养猪或野生猪类中进行，针对特别足经典猪热病毒的感染来进行免疫过程包括以上述的载体对植物进行转化，培育转化后的植物，收获目的植物组织以及以此植物如大麦或大麦麦胚饲养动物；植物组织可不经处理或使其出芽另外，由载体DNA编码的植物蛋白可被纯化成饲料后喂养动物总之，免疫的过程包括以下步骤(1)构建可编码病毒病原体表面免疫蛋白的密码子优化基因；(2)以一个或数个，但不是全数的病毒病原体的表面免疫蛋白基因来转化谷类植物；(3)鉴定、生长及培育转基因植物；(4)收获谷物；(5a)将谷物以饲料或饲料添加剂形式饲养动物或(5b)使大麦麦粒出芽后以饲料与饲料添加剂形式饲养动物序列的简单描述SEQ ID号1是CSFV病毒的E2结构蛋白的氨基酸序列SEQ ID号2是CSFV病毒的编码区优化后E2基因的核苷酸序列SEQ ID号3是大麦的D-大麦醇溶蛋白启动子的序列(播种时)SEQ ID号4是淀粉酶启动子的序列(出芽时)示例例1构建密码子优化的CSFV病毒的E2基因编码CSFV病毒的结构蛋白E2的基因被优化后，其合适的富含GC的三倍体就可用于编码特异氨基酸据此目的，基因从56个寡核苷酸(其中54个含有40个核苷酸，2个含有20个核苷酸)中重组而来在寡聚核苷酸的上游链和下游链中含有终止密码子，在终止密码子后插入了Sacl限制性酶切位点，以利于后续的分子克隆步骤这些寡聚核苷酸是由酶连和PCR等步骤合成的密码子优化的基因是通过“接合PCR”(在Horton etal，1989，Gene 7761-68中)将其与带有大麦醇溶蛋白信号肽的大麦醇溶蛋白启动子的3’端连接，此启动子上有Ncol限制性酶切位点当此基因(包含大麦醇溶蛋白启动子的尾部，大麦醇溶蛋白信号肽和完整的E2基因)被克隆入pUC18载体后，可通过Ncol和Sacl限制性酶切位点将其切下来后，克隆入含有一个完整大麦醇溶蛋白启动子，大麦醇溶蛋白信号肽和终止基因序列的载体中完成克隆后，新构建的载体就形成了，它是一个含有大麦醇溶蛋白启动子，大麦醇溶蛋白信号肽，E2基因和数目终止序列的pUC18例2构建单面或双面的表达CSFV病毒E2蛋白的载体构建好RS265后，将两个载体连接起来，它们均能对土壤杆菌AGLL株进行转化这两个载体其一为单面载体，另一个为双面载体，后者与前者的不同之处在于两个嵌合基因(1)普遍启动子，标记基因，数目终止序列和(2)大麦醇溶蛋白启动子、大麦醇溶蛋白信号肽、E2基因和数目终止序列被一左和右T-DNA边界区域序列包绕，这种结构有利于其整合入植物基因组中在单面载体中，包含有普遍启动子、标记基因、数目终止序列和大麦醇溶蛋白启动子、大麦醇溶蛋白信号肽、E2基因和终止序列仅与一相应的普通T-DNA边界区域序列包绕构建单面载体上述构建的RS265首先以EcoR1进行酶切，酶切位点的重叠末端以T4DNA多聚酶处理，最后进行HindIII剪切有E2基因的纯化片断被连接到一个pUCl8载体上，此载体上已有普遍启动子，标记基因和数目终止序列在连接前先用BamHI和HINDIII进行酶切，在行BamI酶切后将缺口填充后再行HINDIII酶切经过这些步骤后，就得到了RS266(图2)载体整个载体由普遍启动子，标记基因，数目终止序列和大麦醇溶蛋白启动子，大麦醇溶蛋白信号肽，CSFV病毒的E2基因，数目终止序列，后者为通过EcoRV HINDIII酶切并插入到pRS2600载体(图3)的合适位点上而产生的构建好RS268载体(图4)后，可通过电打孔技术对土壤杆菌AgLL株进行转化构建双面载体上述RS265载体是通过HINDIII和EcorI对含有E2的基因片断进行酶切而构建成的，而如上述以进行HindII酶切之后将其末端填充后再以EcoRI进行酶切载体DAM300(图5)是特别用来构建双面载体的，其已含有一个左和右T-DNA边界区域和一个由普遍启动子、标记基因和数目终止序列组成的核苷酸序列将此载体以NotIHindIII进行酶切，再将NotI酶切位点重新连接然后，将RS265的HindiII/EcoRI部分克隆入此载体中这样，一个含有普遍启动子、标记基因，末端终止序列和大麦醇溶启动子、大麦醇溶蛋白信号肽、E2基因，终止序列的单位被以左和右边界序列包绕后，再用EcoRI和HindIII进行酶切后插入这样，就构建好了RS269载体(图6)，可通过电打孔技术对土壤杆菌AgLL株进行转化例3土壤杆菌介导的对金色希望(Golden promise)大麦进行转化将大麦(特别是金色希望品种)在湿盒中进行培育经过2～3个月后，即可收获1.2～2.5mm左右大小胚乳的尚未成熟的大麦种子大麦种子经灭菌，洗涤后，从谷物上分离下来并延长轴方向切开在某种情况下，种子与植物分离前即通过切割种子将胚乳切开具有一定的意义在此发明中胚乳是在种子与植物分离后再进行切割的，然后将胚乳在24℃孵育48小时土壤杆菌AgLL株在经过上述转化载体的转化后，在室温下选择培养基中培养48小时孵育完成后，用细菌悬液感染植物将土壤杆菌与大麦胚乳在空气孵育盒中的孵育时间应根据土壤杆菌的生长情况来定，一般来讲约为48～72小时共同孵育后，将大麦胚乳洗涤至肉眼不可见由于细菌而导致的培养基混浊将胚乳重新种植于选择性平板后，将此平板在24℃空气孵育暗箱中孵育2星期选择性平板上有一种生长激素和选择性物质如bialaphos2星期后，将胚乳重新种植到新的平板中，并将胚芽和胚根除掉又将此平板在24℃的暗盒中孵育2星期2星期后，将胚乳重新种植，然后在合适的光照下进行培育在此期间会长出绿色组织来，当幼小的植物生长足够大时，将其移入盆中使其生根序列表<110>马尔塔根研究股份有限公司(Maltagen Forschung GmbH)<120>生产抗哺乳动物病毒标记疫苗的方法(Process for producing a marker vaccineagainst a mammalian virus)<130>P33126-031<140><141><150>DE10145969.6<151>2001-09-18<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>371<212>PRT<213>经典猪热病毒(virus of classical swine fever)<220><223>E2 protein of classical swine fever virus<400>1Arg Leu Ala Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Ile Ser Ser Thr Asn1 5 10 15Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Glu Gly Leu Thr Thr Thr Trp Lys Glu20 25 30Tyr Ser His Gly Leu Gln Leu Asp Asp Gly Thr Val Lys Ala Val Cys35 40 45Thr Ala Gly Ser Phe Lys Val Thr Ala Leu Asn Val Val Ser Arg Arg50 55 60Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Arg Ala Leu Pro Thr Ser Val Thr Phe65 70 75 80Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Asn Pro Ala Ile Glu Glu Met Asp Asp85 90 95Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe Asp Thr Ser Pro Val Ile Lys100 105 110Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val115 120 125Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Val Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro130 135 140Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Arg Arg 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