牡丹皮提取物用于制备皮肤外用美白组合物的用途及制备方法[0002]黑素是一种高分子量的生物色素，能够起到阻挡紫外线的作用，从而具有从紫外线中保护皮肤的功能。目前已知的有三种，分别为真黑素(Eumelanin)、褐黑素(Pheomelanin)和神经黑素(Neuromelanin),通常所指的黑素是真黑素。当皮肤被紫外线照射后，体内会产生大量的黑色素以保护皮肤。黑色素的含量是皮肤颜色深浅的重要影响因素。黑色素的含量越多，皮肤的肤色就越黑。因而，能够起到抑制黑色素生成的物质被视为具有美白皮肤的作用。[0003]酪氨酸酶是一种多酚氧化酶，属于氧化还原酶类，并且它是黑色素形成过程中的主要限速酶，该酶活性的大小决定了黑色素形成的数量。皮肤细胞中的酪氨酸在酪氨酸酶的作用下，受环境中各种因素的影响，逐渐氧化为多巴和多巴醌，多巴醌再经过一系列的代谢反应，聚合为5，6-吲哚醌，最后逐步转化为皮肤黑色素。[0004]牡丹皮为毛茛科植物牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr)的干燥根皮,具有清热凉血、活血化瘀的作用，主要有温毒发斑、吐血、夜热早凉、无汗骨蒸、经闭痛经、痈肿疮毒、跌扑伤痛等功效。并据文献与相关资料报道，牡丹皮具有抗癌、抗过敏性哮喘以及保肝的药理作用，其主要成分丹皮酚更可降低D-半乳糖胺诱导老龄小鼠的神经毒性，且能改善其认知功能。然而，牡丹皮粗提物在美白化妆品中的应用却未见报道。
[0005]本发明所要解决的 技术问题在于提供一种牡丹皮提取物的新用途。[0006]本发明所要解决的另一个技术问题在于提供上述用途中牡丹皮提取物的制备方法。[0007]本发明所要解决的再一技术问题在于提供一种美白组合物。
[0008]本发明解决上述技术问题所采取的技术方案是提供一种牡丹皮提取物用于制备皮肤外用美白组合物的用途。
[0009]这里使用的术语“皮肤”不仅包括覆盖动物的脸或身体表面的组织，而且还包括头皮和毛发。
[0010]这里所使用的术语“提取物”是指，用任何方法从自然物质中提取成分而获得的任何物质。所述提取物包括，从天然物质中使用有机溶剂或水提取的可溶于所述溶剂的成分，以及从天然物质中提取的特定成分。
[0011]所述牡丹皮提取物具体包含用于抑制酪氨酸酶的成分，其对酪氨酸酶的活性具有显著的抑制效果。[0012]本发明解决上述技术问题所采取的另一技术方案在于提供上述用途中牡丹皮提取物的制备方法，所述牡丹皮提取物的制备包括下述步骤:
(1)将牡丹皮用有机醇水溶液提取，得提取液；
(2)提取液浓缩、干燥，得粗提物浸膏；
(3)粗提物浸膏用水分散成混悬液，用大孔树脂柱进行分离纯化，并多次洗脱，得洗脱
液；
(4)洗脱液浓缩、干燥，得到牡丹皮提取物。
[0013]步骤(2)中提取液的浓缩方式为蒸发浓缩或减压浓缩，所述的干燥方式为减压干燥或真空冷冻干燥，至溶剂完全挥发。[0014]步骤(4)中洗脱液的浓缩方式为蒸发浓缩或减压浓缩，所述的干燥方式为减压干燥或真空冷冻干燥，至溶剂完全挥发。
[0015]所述的牡丹皮为毛茛科植物牡丹干燥根皮。
[0016]步骤(1)中，加入牡丹皮10~30倍重量的70~95%的有机醇水溶液，在65~95°C下回流提取I~10小时。
[0017]步骤(1)中用于提取的有机醇水溶液优选为牡丹皮重量的15~25倍，更优选20倍。提取温度优选70~90°C，提取时间优选3~7小时，更优选4~6小时。
[0018]步骤(3)中，依次用2~5倍树脂柱体积的水洗脱、I~3倍树脂柱体积的体积分数为20%~40%的有机醇水溶液洗脱、2~4倍树脂柱体积的体积分数为45%~70%的有机醇水溶液洗脱、2~5倍树脂柱体积的体积分数为85%~95%的有机醇水溶液洗脱；所述的有机醇为甲醇、乙醇以及丙醇中的一种或多种。
[0019]洗脱步骤优选依次用3~4倍树脂柱体积的水洗脱、2~3倍树脂柱体积的体积分数为25~35%的乙醇水溶液洗脱、2.5~3.5倍树脂柱体积的体积分数为55~65%的乙醇水溶液洗脱和2.5~3.5倍树脂柱体积的体积分数为88~92%的乙醇水溶液洗脱。洗脱后，经过浓缩与干燥，得到各部位的牡丹皮提取物。
[0020]本发明解决上述技术问题所采取的再一技术方案在于提供一种皮肤外用美白组合物，包含由上述制备方法得到的牡丹皮提取物。
[0021]所述的牡丹皮提取物在组合物总量中的质量百分比为0.01~10%。
[0022]牡丹皮提取物在组合物总量中的质量百分比为优选为0.05~2%。
[0023]所述外用组合物为外用化妆品组合物或外用药品组合物。
[0024]所述组合物还包括除牡丹皮提取物之外的美白剂、抗衰老成分、抗氧化剂、维生素、多肽、多糖、鞘脂中的一种或多种。在不影响本发明的目的及效果的前提下，本领域的技术人员可容易地选择所述化妆品组合物中的上述组成物的含量。
[0025]所述组合物还可以包含保湿剂、润肤剂、表面活性剂、紫外吸收剂、防腐剂、消毒齐?、抗氧化剂、pH调节剂、有机和/或无机颜料、调味剂、冷却剂、止汗剂等能提高所述组合物的主效果的且不影响其主效果的成分。
[0026]所述组合物的剂型为溶液、乳液、悬浮液、霜剂、凝胶、泡沫或喷雾。
[0027]对于外用化妆品组合物而言，可以为适于局部涂抹的任何剂型。例如，所述化妆品组合物可以为固体、溶液、乳液(水包油型乳液、油包水型乳液)、悬浮液、霜剂、凝胶、浆糊、泡沫或喷雾形式的组合物，但不限于这些剂型。这些剂型可以通过本领域所熟知的任何常用方法来制备。
[0028]对于外用药物组合物而言，亦可以为适于局部涂抹的任何剂型。例如，所述药物组合物可以为固体、溶液、乳液(水包油型乳液、油包水型乳液)、悬浮液、霜剂、凝胶、浆糊或喷雾形式的组合物，但不限于这些剂型。
[0029]根据本领域所熟知的任何常用方法，可以通过使用表面活性剂、赋形剂、保湿剂、乳化剂、悬浮剂、用于渗透压的盐或缓冲剂、着色剂、调味剂、稳定剂、防腐剂或其他常用的添加剂来制备所述药物组合物的剂型。
[0030]本发明的有益效果:
由本发明的制备方法得到的牡丹皮提取物，通过抑制酪氨酸酶(tyrosinase)的活性达到抑制黑色素(melanin)的产生而表现出皮肤美白作用，并且有一定的稳定性，能用于制备皮肤外用组合物，显示出皮肤美白功效。

[0031 ] 下面将通过描述实施例来进一步的描述本发明，但本发明的内容不仅限于此。
[0032]实施例1:牡丹皮提取物的制备 取牡丹皮清洗、干燥，除去杂质，备用。
[0033](I)称取一定量的牡丹皮，用20倍量90%的乙醇水溶液进行提取，70~90°C下提取4~6小时，提取液经过静置、过滤、浓缩、干燥至溶剂完全挥发，得到牡丹皮粗提物浸膏(提取物A)；
(2)浸膏用水分散后，采用大孔吸附树脂柱进行分离纯化，依次用4倍树脂柱体积的水、3倍树脂柱体积的体积分数为30%的乙醇水溶液、3倍树脂柱体积的体积分数为60%的乙醇水溶液和3倍树脂柱体积的体积分数为90%的乙醇水溶液进行洗脱，分别收集各部位的洗脱液，浓缩，真空干燥或冷冻干燥至溶剂完全挥发，得到各部位的牡丹皮提取物。其中，用水洗脱得到的洗脱液标为提取物B，用30%的乙醇水溶液洗脱得到的洗脱液标为提取物C，用60%的乙醇水溶液洗脱得到的洗脱液标为提取物D，用90%的乙醇水溶液洗脱得到的洗脱液标为提取物E。
[0034]牡丹皮粗提物浸膏(提取物A)在B16细胞中的毒性评价
取胰酶消化对数期的单层细胞，并将细胞收集至培养瓶中；计数并调整细胞悬液浓度至2.5X IO3~50X IO3个/mL ;铺96孔板并置于5%C02培养箱中培育24h ；加入用溶剂溶解的不同浓度的牡丹皮提取物A样品或对照样品并继续培育48h;取出，加入现配的5mg/mL的MTT (噻唑蓝)溶液，每孔20 μ L并继续培育4h ;弃上清并每孔加入150yL的二甲亚砜，放置15分钟，溶解蓝紫色结晶；震荡并用酶标仪于490nm下测试吸光度值，并计算出各个药物在所选浓度下的细胞存活率。(存活率=