专利名称：一种大木枣叶柄多倍体诱导方法我国是枣树发源地，黄河峡谷流域是枣树的发源地和优生区之一。陕北地区枣树种植资源丰富。大木率为鼠李科(Rhamnaceae)率属(Zizyphus jujube Mill Damuzao)制干栽培种，因其平均果重达30. 3g而得名。大木枣适应性强，对环境条件要求不严格，在盐碱地上也能正常生长，是陕北地区广泛栽培的品种。在果树生产和贸易上具有十分重要的地位。但因其果实大小不整齐、有畸形果、有裂果等缺点。在生产上，果农往往采用农药和化肥帮助树体避害趋利。这不仅造成果树营养匮乏，同时严重影响果实品质。由于大木枣枣花较小，胚胎容易退化，难以通过正常的杂交育种进行品质改良。到目前为止大木枣的新品种选育工作还停留在通过芽变优中选优的阶段。育种周期及常，效率十分低下。多倍体(polyploid)是指具有3套或3套以上完整染色体组的生物体(自然界中存在并确定的枣树多倍体为赞皇大枣，是三倍体)。自1937年布莱克斯和埃弗里 (B-Iakeslee和Avery)采用曼陀罗等植物发现用秋水仙素(colchicine,简称⑶LC)诱导多倍体的方法以来，植物倍性育种已取得了巨大进展，已获得了大量作物、果树、蔬菜、园林和花卉等多倍体新品种。植物多倍体的形成途径主要有三个。一是合子或体细胞染色体数加倍形成多倍体；ニ是生殖细胞(或性细胞)減数分裂不正常，使染色体不减半，形成2n配子，或減数分裂后的配子有丝分裂过程染色体加倍产生2n配子，未減数分裂配子的受精结合形成多倍体；三是体细胞融合(杂交)而形成多倍体。有关枣树组织培养的报道较多，但通过叶片培养获得再生植株报道很少。胡影等 (1993)在改良的B5培养基上通过不同浓度的激素组合获得了民勤小枣嫩叶的愈伤组织， 20d诱导率最高可达100%，通过分化培养60d是不定芽和不定根的分化率均可达到50%。 陈宗礼等(2007)以木枣、骏枣和狗头枣的组培苗叶片为材料，愈伤组织诱导率最高达到 72. 93%，分化率最高达到38. 33%。齐向英等(2011)以大木枣叶柄愈伤组织为材料通过分化培养可使分化率最高达到50. 82%。目前报道的枣树多倍体主要是通过第一种途径来形成的。刘贵仁(1995)等通过金丝小枣愈伤组织培养获得的同源四倍体。其后通过秋水仙碱用不同材料诱导出多种枣树的同源四倍体。严仁玲(1996)等用枣树组培苗通过秋水仙碱诱导出金丝小枣的同源四倍体，并发现用0. 4%的秋水仙碱浸泡48h诱变率可达到22. 5%。同时成活率达到了 64.5%。 蒋洪恩(2004)等在大田以冬枣、临猗梨枣和辣椒枣一年生嫁接苗为试材，研究发现0. 15% 秋水仙碱处理茎尖18h，临猗梨枣诱变率可达50% ；0. I %秋水仙碱处理30h冬枣的诱变率达到43. 3%；0. 15%处理18h辣椒枣的诱变率最高可达43. 3%。并且在辣椒枣中还发现了染色体数为2n = 2x+2 = 26及DNA含量为八倍体的细胞。王娜(2005)等用组培苗丛生芽和茎段诱导出了冬枣和酸枣四倍体。并对不同的诱变方式做了研究。发现酸枣和冬枣丛芽在含50mg/L秋水仙素的MS培养基混培处理40d，诱变频率分别为36. 67%和26. 67% ;酸枣茎段在含O. 4%的秋水仙素溶液处理4d诱变频率为23. 33% ;冬枣茎段在同浓度的秋水仙碱溶液中处理为2d诱变率为16.67%。齐向英(2007)等通过茎段诱变获得了狗头枣、 骏率和木率的同源四倍体。狗头率为秋水仙碱10mg/l、处理45天或50mg/l处理30天,诱变率均为33. 3% ;骏枣为秋水仙碱30mg/l、处理30天，诱变率为40. 0% ;木枣为秋水仙碱 30mg/l、处理45天，诱变率可达46. 7%。宁强(2008)等在大田冬枣和临猗梨枣的愈伤组织然后再用秋水仙碱处理临猗梨枣和冬枣分别以O. 05%秋水仙素处理24h和18h的诱变率分别达到13. 3%和6. 7%0目前报道的为金丝小枣、冬枣、临猗梨枣、辣椒枣、酸枣、狗头枣、骏枣和木枣是与大木枣基因型完全不同的枣树栽培品种，它们在秋水仙碱处理程序、培养方式上均是不相同的。最主要的是它们所用的材料愈伤组织(主要是通过细胞有丝分裂过程异常或者自发性细胞融合来获得多倍体)、组培苗丛生芽和茎段、大田苗幼茎和大木枣叶片是分化程度和基因型完全不同的材料。不论用茎尖、茎段对枣树均有交大程度伤害。
针对现有技术不足，本发明解决的问题是针对现有技术的不足提供一种大木枣叶柄多倍体诱导方法。本发明涉及的内容包括①大木枣试管苗培养过程及叶片取材时期，②以大木枣试管苗叶片为材料通过秋水仙碱处理获得变异植株，③变异植株的筛选方法。其特征在于① 将大木枣无根试管苗接种在枣树生长培养基上，在散光照射下先培养7d，然后在光照14h/ d、光照强度为15001x±2001x、相对湿度70% ±5%的条件下培养25d。②取其顶端完全展开的三片带叶柄的叶子为材料。将材料接种在含秋水仙碱10 50mg/L不等的率树生长培养基中。分别于培养IOd 30d后转移到不含秋水仙碱的枣树生长培养基上。等待形成新的芽体。③等新芽体形成后按照单个芽体接种在原枣树生长培养基上，采取由表及里的方法来筛选多倍体，与原种大木枣试管苗作对比，具体为先观察新生苗的叶片是否变得皱褶、 节间茎是否变粗；然后选取发生变异的叶片观察气孔数量是否发生变化，对发生变化的植株再进行染色体观察来确定变异植株。本发明中涉及的枣树生长培养基基本成分为氯化钙(CaCl2 · 2H20) 330mg/L,硝酸氨(NH4NO3) 1400mg/L，硝酸钾(KNO3) 1600mg/L，硫酸镁(MgSO4 · 7H20) 300mg/L，磷酸二氢钾(KH2PO4) 185mg/L，硫酸亚铁(FeSO4 · 7H20) 29mg/L,己二胺四乙酸二纳(Na2EDTA) 40mg/ L,硼酸(H3BO3) 12mg/L，硫酸锰(MnSO4 · H2O) 20. Omg/L,硫酸锌(ZnSO4 · 7H20) 11. Omg/L, 钥酸钠(NaZMoO4 · 2H20) O. 30mg/L,硫酸铜(CuSSO4 · 5H20) O. 030mg/L,盐酸硫胺素(维生素BI) I. 2mg/L,盐酸紙卩多辛(维生素B6)0. 6mg/L,烟酸O. 6mg/L,肌醇100mg/L,氨基己酸 2. Omg/L,蔗糖 30g/L,琼脂 5. 5g/L，6-卞氨基腺嘌呤(6-BA) I. 5mg/L，噬苯隆(TDZ) O. Olmg/ L，3-吲哚乙酸(IBA)O. 2mg/L，pH = 5. 8。本发明中的率树为大木率为鼠李科(Rhamnaceae)率属(Zizyphus jujube Mill Damuzao)制干栽培种。本发明中的大木枣为陕北地区栽种大木枣。本发明中所取大木枣叶柄为枣树试管苗顶端向下展开的三片叶子。本发明中诱导过程是将带叶柄的叶片接种在含有10 50mg/L不等的枣树生长培养基中并分别于培养IOd 30d后转移到不含秋水仙碱的枣树生长培养基上，等待新芽体的形成。本发明的多倍体鉴定过程是新芽体形成后按照单个芽体接种在原枣树生长培养基上，通过和原种试管苗对比按照由表及里的方法，先判断外部形态的叶片、茎段；然后通过气孔、染色体数目来确定多倍体。本发明以大木枣叶柄为外植体，利用组织培养和秋水仙碱诱变相结合的方式，来诱导染色体加倍，同时ー步分化获得大木枣是四倍体植株。并建立起枣树四倍体鉴定的由表及里的筛选方法。以叶柄为材料不但取材方便，而且几乎不伤害枣树。图I大木枣叶柄诱导出的四倍体植株;A、为叶柄在培养基内诱导出的四倍体植株、为叶柄在培养基外诱导出的四倍体植株；图2大木枣二倍体和四倍体;A、为二倍体木枣继代苗；B、为四倍体木枣继代苗； 图3大木枣二倍体和四倍体染色体;A、为二倍体大木枣染色体数目(2n = 2x = 24) (100*10) ;B、为四倍体大木枣染色体数目(2n = 4x = 48) (100*10)。

2.Omg/L,蔗糖 30g/L,琼脂 5. 5g/L，6-卞氨基腺嘌呤(6-BA) I. 5mg/L,噬苯隆(TDZ) 0. Olmg/ L，3-吲哚こ酸(IBA)O. 2mg/L，pH = 5. 8。步骤I、将上述枣树生长培养基按每升的需要量先配成溶液，分装在150ml的三角瓶中。在121°C，高压灭菌21min，然后取出，放置在净化工作台上，等培养瓶温度降至50°C 时，用过滤灭菌的方式加入秋水仙碱溶液。步骤2、将在枣树生长培养培养的大木枣无根试管苗(条件在散光照射下先培养7d，然后在光照14h/d、光照强度为15001x±2001x、相対湿度70% ±5%的条件下培养 25d)。将由顶端向下完全展开的三片带叶柄的叶子,接种在含秋水仙碱10mg/L、30mg/L、 50mg/L不等的枣树生长培养基中。步骤3、在含秋水仙碱的培养基上培养10d、20d、30d不等的时间段内，将叶片转入不含秋水仙碱的枣树生长培养基上继续培养，等待新芽体的形成(见图1A、B)。步骤4、将新生成的芽体转入枣树生长培养基上培养，等形成无根试管苗后，和原种大木枣试管苗做对比，研究其形态变化(见图2A、原种二倍体大木枣试管苗；B、变异植株大木枣试管苗)。具体为先观察新生苗的叶片是否变得皱褶、节间茎是否变粗；然后选取发生变异的叶片观察气孔数量是否发生变化，对发生变化的植株再进行染色体观察来确定变异植株。实验结果表明，变异苗的叶片变得皱褶、节间明显变粗短用游标卡尺测量结果显示二倍体节间为I. 13±0. 0021cm，变异植株节间长度为O. 666±0. 0318cm。茎段粗度二倍体为 I. 035±O. 0007mm.，变异植株粗度为 I. 955±O. 0044mm。步骤5、对原种大木枣试管苗和发生变异的大木枣试管苗做气孔观察结果显示二倍体大木枣气孔长度为20. 66±0· 0333mm、气孔宽度为15. 23±0· 1169mm、气孔密度为 83. 61 ± I. 7532/mm2 ;变异植株气孔长度为 41. 63±0· 1287um ;宽度为 25. 18±0· 1143um ;气孔密度为61. 73个/mm2。
步骤6、对二倍体大木枣试管苗和变异植株做染色体，按照陈瑞阳(1985)等去壁染色法，对有效的30个中期分裂相做染色体计数，其中原种大木枣试管苗统计的3次，共 90个分裂相中90个全部为2n = 2x = 24条。变异植株3次共90个分裂相中分别为第一次28个为48条，一个为45条、一个为47条；第二次均为48条；第三次29个为48条、一个为51条。根据陈瑞阳(1985)等核型分析标准化及物种染色体数目确定要求统计30个分裂相中有85%为恒定数目。我们统计的二倍体为100%，变异植株分别为93. 33%、100%、 96. 67%，所以确定变异植株为四倍体(见图3A原种大木枣试管苗染色体数目2n = 2x = 24 ;B、为变异的四倍体大木枣染色体数目2n = 4x = 48)。步骤7、按上述4、5、6的方法对处理的所有植株做判断，在所有处理中含秋水仙碱 10mg/L，培养10d，共150个外植体中得到I株四倍体变异植株，约为O. 667% ;含秋水仙碱 10mg/L、培养20d，133个外植体中共得到9株四倍体变异植株，约为6. 77% ;含秋水仙碱 10mg/L、培养30d、139个外植体中共得到12株四倍体变异植株，约为9. 02%。含秋水仙碱 30mg/L、培养10d，共108个外植体中得到31株四倍体变异植株，约为28. 7% ;含秋水仙碱 30mg/L、培养20d、共179个外植体中共得到83株四倍体变异植株，约为46. 4% ;含秋水仙碱30mg/L、培养30d，152个外植体死亡33株，共得到15株四倍体变异植株，约为9. 87%。 含秋水仙碱50mg/L、培养10d，108个外植体中共得到37株四倍体变异植株，约为34. 26%； 含秋水仙碱50mg/L、培养20d，115个外植体有71株死亡，没有得到四倍体变异植株；含秋水仙碱50mg/L、培养30d，共139个外植体全部死亡。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。


本发明公开了一种大木枣叶柄多倍体诱导方法，包括以下步骤①将大木枣无根试管苗接种在枣树生长培养基上，在散光照射下先培养7d，然后在光照14h/d、光照强度为1500lx±200lx、相对湿度70％±5％的条件下培养25d；②取其顶端向下完全展开的三片带叶柄的叶子接种在含秋水仙碱10-50mg/L的枣树生长培养基中；于培养10d-30d后转移到不含秋水仙碱的枣树生长培养基上，等待形成新的芽体；③等新芽体形成后按照单个芽体接种在原枣树生长培养基上。本发明以大木枣叶柄为外植体，利用组织培养和秋水仙碱诱变相结合的方式，来诱导染色体加倍，同时一步分化获得大木枣是四倍体植株。