专利名称：一种基因组dna提取方法提取基因组DNA用于PCR分离基因、Southern杂交、基因组文库构建等。由于提取基因组DNA花费时间长，因此，通常会通过一次性提取较多DNA节约人力物力，而对于DNA 需求量较大的实验如基因组文库构建，一次性获取较多DNA就相当必要了。提取基因组DNA的方法很多，如浓盐法、阴离子去污剂法、酚氯仿抽提法、水抽提法等，但总的方法步骤和原理为DNA分离根据浓盐法、阴离子去污剂法、酚氯仿抽提法或水抽提法提供的试剂将已破碎细胞的溶液中的基因组DNA与蛋白质、脂类、糖类、RNA等分离，获得DNA水溶液；DNA析出在DNA水溶液中加入0. 8倍体积的异丙醇或2倍体积的无水乙醇使DNA 析出；DNA洗涤干燥析出DNA后，通过离心弃上清获取DNA沉淀，再将沉淀用70%乙醇洗涤2-3次，并于室温干燥；DNA 溶解保存加入水或 TE 溶液(10mmol/L Tris-Cl、lmmol/L EDTA · 二钠、pH 8. 0)溶解已干燥的DNA，放-20°C存放。为获取较多DNA首要采用的方法是增加用于提取DNA的材料的量，与之相适应，提取DNA时选择容积较大的容器，一般采用5-50ml离心管(提取少量DNA时一般使用1. 5ml 离心管)。当然，通过实验过程中的操作规范和一些操作方法的改进也会适当增加DNA提取的量。现有文献中，由高等教育出版社2007年出版、魏群主编的《分子生物学实验指导》 (第2版)的第二篇实验九植物基因组DNA的提取，采用酚氯仿抽提法提取基因组DNA，采用 50ml离心管为容器以一次性提取较多的实验材料；由武汉大学出版社2009年出版、严海燕主编的《基因工程与分子生物学实验教程》的实验一植物基因组DNA的提取和酶切，采用酚氯仿抽提法提取基因组DNA，采用7ml离心管为容器以一次性提取较多的实验材料。但是， 由于一次性提取的DNA量较多，在最后加入水或TE溶液溶解DNA时，大量DNA成团无法溶解。虽然可以采用高温水浴加热或用枪头吸打溶液的方法促使DNA溶解，但一般谨慎采用， 因为高温水浴加热所需时间长、会造成DNA降解、而且溶解仍不完全；枪头吸打溶液会造成 DNA机械性剪切，使DNA长度达不到后续实验要求。DNA不能快速充分溶解直接造成其浓度低，则DNA的有效质量低，无法满足后续实验对DNA质量的要求，尤其是构建基因组文库。并且，在现有提取基因组DNA方法中，没有对DNA做质量预测，也没有对DNA做浓度预测的具体方法的提出，在溶解DNA时加入的水或TE溶液的体积仅凭运气或凭经验、无法掌控，极易造成浓度达不到后续实验要求的浓度范围而使DNA提取实验功亏一篑。因此，很有必要寻找一种在不影响DNA长度的情况下，使DNA快速充分溶解，且保证DNA浓度达后续实验要求的提取方法。
本发明所要解决的技术问题是提供一种基因组DNA提取方法，在不影响DNA长度的前提下可以使DNA快速、充分溶解，且保证DNA浓度达后续实验要求。 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种基因组DNA提取方法，包括DNA分离、DNA析出、DNA洗涤干燥和DNA溶解保存，所述DNA分离得到的DNA水溶液平均分装到多个1. 5-5ml小离心管中；所述DNA溶解保存前对所述小离心管中DNA进行质量预测。DNA水溶液通过分装后再分别进行DNA析出、DNA洗涤干燥和DNA溶解保存，由于每个小离心管中DNA的量少，则DNA溶解保存时加入少量水或TE溶液即可快速溶解干燥的DNA，该方法利用增加溶质与溶剂接触面积提高溶解速度和溶解程度的原理，甚至不需吹打、不需加热就能使DNA快速充分溶解，从而解决DNA溶解难的问题；不吹打不加热也降低了 DNA断裂的几率，保证了 DNA的长度。通过平均分装，使DNA质量预测成为可能，以便控制DNA浓度达后续实验要求。优选的，所述DNA水溶液平均分装到多个1. 5ml小离心管中。1. 5ml小离心管底部尖细，离心时有利于DNA沉积并贴于管底，且加入少至5 μ 1体积的溶剂就能覆盖管底、覆盖 DNA,即使DNA干燥后肉眼不易看见也能保证其被完全覆盖而溶解。所述DNA质量预测为向所述DNA洗涤干燥后的任一只小离心管中加入5_50 μ 1的水或TE溶液后检测DNA浓度，并根据此浓度和体积得到DNA的质量。由于平均分装，每个小离心管中DNA的量大致相同，根据预测的质量向其余小离心管加入合适的水或TE溶液可以保证浓度达后续实验的要求，不至于盲目地或凭经验地加入水或TE溶液溶解DNA而导致浓度达不到后续实验要求。DNA浓度的可控制节约了实验时间和实验成本，大大提高了实验的成功率。所述DNA质量预测还可以为向所述DNA洗涤干燥后的任意2_4只小离心管中各加入相同体积的水或TE溶液后检测DNA浓度并取平均值，并根据此浓度和体积得到DNA的平均质量。平均质量的获取使DNA浓度的控制更为准确。所述检测DNA浓度可以通过测定吸光值0D26(I/0D28(i或者通过琼脂糖凝胶电泳得到。本发明通过分装DNA水溶液，在DNA溶解保存时增加了 DNA与溶剂的总的接触面积，在不影响DNA长度的前提下即可使提取的DNA快速充分溶解；通过分装，还使得DNA质量预测变为可能，则可以保证提取的DNA的浓度达后续实验要求。与现有技术相比，DNA溶解保存时其溶解速度大大提高，溶解程度更是由现有技术的成团不易溶解变为完全溶解； DNA质量的可预测，使得在DNA溶解保存时其浓度可控制，解决了现有技术盲目地或凭经验地加入溶剂溶解DNA导致浓度达不到要求而失败的问题。图1为本发明实施方式提取DNA的流程图；图2为本发明实施例所提取DNA的电泳图谱。
DNA分离根据浓盐法、阴离子去污剂法、酚氯仿抽提法或水抽提法提供的试剂将已破碎细胞的溶液中的基因组DNA与蛋白质、脂类、糖类、RNA等分离，获得DNA水溶液；DNA水溶液分装将分离得到的DNA水溶液平均分装到1. 5_5ml小离心管中。DNA 水溶液通过分装，每个小离心管中DNA的量少，则DNA溶解保存时DNA与水或TE溶液总的接触面积增大，提高了 DNA的溶解速度和溶解程度，甚至不需吹打、不需加热就能使DNA快速充分溶解，从而也解决了 DNA溶解难的问题；不吹打不加热也降低了 DNA断裂的几率，保证了 DNA的长度。尤其是1. 5ml离心管，其底部尖细，更有利于DNA沉积管底，而且加入少至5μ 1体积的溶剂就能覆盖管底、覆盖DNA，有利于DNA溶解。DNA析出在分装了 DNA水溶液的小离心管中加入0. 8倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇使DNA析出；DNA洗涤干燥析出DNA后，离心并倾倒上清则DNA沉积于管底，再用70%乙醇洗涤DNA2-3次，并于室温干燥；DNA质量预测对于平均分装得到的DNA，洗涤干燥后，向任一只小离心管中加入 5-50 μ 1的水或TE溶液，取部分通过测定吸光值OD26tZOD28tl或者通过琼脂糖凝胶电泳得到 DNA浓度，也可以是向任意2-4只小离心中加入水或TE溶液测定DNA浓度并取平均值，根据得到的浓度和体积得到DNA的质量。DNA溶解保存根据预测的质量和后续实验的浓度要求，向其余小离心管中加入合适体积的水或TE溶液，放-20°C存放。通过对DNA质量预测，可以控制DNA的浓度，不至于盲目地或凭经验地加入水或TE溶液溶解DNA而导致浓度达不到后续实验要求。节约了实验时间和实验成本，大大提高了实验的成功率。与现有技术相比，DNA溶解保存时其溶解速度大大提高，溶解程度更是由现有技术的成团不易溶解变为完全溶解；DNA质量的可预测，使得在DNA溶解保存时其浓度可控制， 解决了现有技术盲目地或凭经验地加入溶剂溶解DNA导致浓度达不到要求而失败的问题。实施例以酚氯仿抽提法结合本发明方法提取蝗虫基因组DNA，具体步骤如下101. DNA分离取新鲜的蝗虫大腿肌肉在液氮中迅速研成粉末；向一 50ml离心管中加入体积约1. 5ml所述粉末，再加入15mlDNA裂解液(0. lmol/L NaCl,0. 01mol/L EDTA · 二钠、0. lmol/L Tris,2% SDS、pH 8. 0)，轻轻吹打使粉末完全溶解；加入RNA酶使终浓度为20 μ g/mL,加入蛋白酶K使终浓度为100 μ g/mL, 50°C温育3小时，裂解细胞，消化蛋白；再加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合物(体积比25 24 1)，轻轻混勻，分层后，以转速为6500rpm离心10分钟，吸取上层于另一 50ml离心管中；在获得的上层溶液中加入等体积的氯仿、异戊醇混合物(体积比24 1)，轻轻混勻，分层后，转速6500rpm离心10分钟， 上层即为DNA水溶液(约IOml)。102. DNA水溶液分装将101得到的DNA水溶液平均分装到25个1. 5ml离心管中，每管溶液约400μ 1。与现有技术将上清全装入一个50ml离心管中相比，通过分装每个离心管中的DNA的量少，有利于之后DNA在TE溶液中的充分溶解和快速溶解；通过平均分装， 每个离心管的溶液所含DNA的量相同，则在DNA洗涤并干燥后，对其中1只或几只小离心管中的DNA进行浓度检测、计算DNA重量，可以控制其余小离心管中DNA的浓度达后续实验要求。103. DNA析出向所述分装的1. 5ml离心管各加入800 μ 1无水乙醇，于_20°C放置 8-12小时使DNA析出。104. DNA洗涤干燥将放置8-12小时的1. 5ml离心管于4°C、IOOOOrpm离心10分
钟，倾去上清，DNA沉淀聚集并贴于管底；用少量的70%乙醇漂洗沉淀2次，4°C、6500rpm离心10分钟，沉淀贴于管底，倾倒上清，并于室温风干沉淀。105. DNA质量检测向其中一只1. 5ml离心管加入20 μ ITE溶解，并取1_2 μ 1检测吸光值0D260/0D280值，得到浓度约为300mg/ml，计算得该1. 5ml离心管中DNA重量为 6mg。与现有技术相比，1. 5ml离心管管底尖细，沉淀贴于管底，加入少至5 μ ITE溶液足以覆盖沉淀，即使DNA风干后肉眼不易看见也能使其完全覆盖而溶解；通过测量其中一只1. 5ml 离心管中DNA的量获得合适的TE溶液的体积，可使其余1. 5ml离心管中的DNA浓度达到后续实验的要求，不至于因为浓度的原因导致实验失败。106. DNA溶解保存根据105得到的小离心管中DNA的重量，以及后续实验对 DNA浓度要求，若后续实验要求DNA浓度为500-1000mg/ml，则可以向其余小离心管加入 10 μ ITE溶液，浓度为600mg/ml达到要求，可以将DNA溶液合并于1只离心管中，_20°C保存待用。 以上述方法得到浓度约为600mg/ml的DNA溶液共240 μ 1 ； 0D260/0D280值为 1. 86，纯度高；观察DNA电泳图如图2 (Μ为Low Range PFG DNAMarker, 1为提取的DNA样品)，提取的DNA长度在80-200kb。该方法得到的DNA纯度高、长度长，能够较好地适用于 PCR分离基因、Southern杂交、基因组文库构建等。本发明所举实施方式或者实施例对本发明的目的、技术方案和优点进行了进一步的详细说明，所应理解的是，以上所举实施方式或者实施例仅为本发明的优选实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明精神和原则之内对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护范围之内。


本发明涉及一种基因组DNA提取方法，包括DNA分离、DNA析出、DNA洗涤干燥和DNA溶解保存，所述DNA分离得到的DNA水溶液平均分装到1.5-5ml小离心管中；所述DNA溶解保存前对所述小离心管中DNA进行质量预测。本发明通过分装得到多份少量DNA，则DNA溶解保存时增加了DNA与溶剂的总的接触面积，在不影响DNA长度的前提下即可使提取的DNA快速充分溶解；所述DNA溶解保存前对平均分装的小离心管中DNA进行质量预测，通过质量预测可以控制DNA的浓度达后续实验要求。