专利名称：南极假单胞菌生防菌株及其生防制剂的制备方法众所周知，传统的化学农药存在安全性低、残留量大，毒素难以降解等问题，不合理的使用往往会造成了水体、土壤、大气污染和农产品中有毒物质残留，严重危及生态系统和人类健康，已成为制约人类环境治理、健康生存、农业稳步增长和可持续发展的重要因素。目前，世界各国均重视开发安全性高、残留量低、无公害、生物活性高、选择性强的生物农药，以替代目前广泛使用的化学农药或减少化学农药的使用量。由于南极的地理环境具有独特的地质及气候特征，形成低温、高盐、强辐射等自然环境，造就了极地微生物在基因组成、酶学特性以及代谢调控等方面独特的分子生物学机制与生理生化特性，是世界上结构新颖、功能独特的化学物质的发源地。近几年我国学者从极地海洋环境，筛选获得对植物病原真菌具有抑制作用，或者对害虫具有较强触杀和胃毒作用的微生物，说明极地微生物在生物农药应用上具有极大的潜力。因此从极地微生物中发现不同种类的菌株应用于植物病害的生物防治，对极地微生物资源的开发利用具有重要的意义。假单胞菌能产生多种抗生素和其它化学物质，能改善植物营养，促进植物生长，且能降解土壤中的有毒物质，对植物促生长和防病作用显著，部分假单胞菌株还具有杀虫功能。从海冰或海泥中获取假单胞菌菌株是生物农药技术的重大突破，也是研发和利用南极海冰资源的迫切需要。因此，从南`极海冰或海泥中，获取假单胞菌菌株、进一步开发假单胞菌系列生物农药产品，是目前人类整治生存环境、防止农作物污染，确保食品安全的迫切需要。
本发明的目的在于提供一种能消除上述缺点，具有方法简单、结构新颖、活性独特、性能稳定、功能奇特、成本低廉、杀菌率高、农用药效价值大，可促进生物生长、降解有毒物质等特点的南极假单胞菌生防菌株及其生防制剂的制备方法。尤其是采用液体深层发酵等科学的试验手段，首创性的从海冰或海泥中获得微生物-假单胞菌菌株，进而研发出其保存和制备方法，开创了假单胞菌菌株农药综合利用的新方法和途径，开发了南极海泥或海冰微生物的在农业上的药用价值和用途，实现了从南极海泥或海冰中获取假单胞菌后制备生防菌株的方法，有效地预防和抑制农作物等植物病虫害和病菌的发生，同时自然资源得到有效地开发和利用，降低了生产和使用成本，提高了社会和经济效益，从海泥或海冰的微生物中获得假单胞菌菌种是生物农药技术的重大突破，为开发研究以防止农作物污染、确保食品源安全为宗旨的农药产品奠定了基础，是理想的从南极海泥或海冰中获取假单胞菌生防菌株的制备方法。本发明的南极假单胞菌生防菌株，是从南极海冰或海泥中分离获得的海洋细菌，2011年10月14日已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记入册编号CGMCC No. 5346，经鉴定参椐的生物材料(株)P4_11，分类命名为假单胞菌Pseudomonassp.。是用于植物病害生物防治的海洋细菌。所述的海洋细菌，其保存方法是采用试管斜面法，培养基蛋白胨3-5g，酵母粉0. 5-lg，琼脂粉15-17g，陈海水120-200毫升，自来水800-880毫升，pH值7. 0-7. 2。在试管斜面上划线接种生防菌株，于10_15°C，培养24-48小时后，于3-5°C保存。专用于南极假单胞菌生防菌株的生防制剂的制备方法，其保存的生防菌株制备发酵种子液，是将试管斜面保存的生防菌株接种于种子培养基中，该培养基的组分为蛋白胨3-5g，酵母粉0. 5-lg，陈海水120-200毫升，自来水800-880毫升，pH值7. 0-7. 2，于10-15°C，150转/分钟振荡培养24-48小时后进行深层发酵获得。其制备的发酵种子液进行深层发酵，是在培养基麸皮5-6g，酵母粉3g-4g，陈海水150毫升，自来水850毫升，灭菌后pH值为7.0-7. 2条件下进行。100L发酵罐的加料量为70L，按以5-7%质量百分数接种制备的种子液。发酵温度利用外接低温循环水控制，罐内温度保持在13°C 土 TC ;罐内压力控制在0. 02Pa;搅拌速度为220-250转/分，通过空气压缩机向罐内通入压缩空气，以提供发酵过程中需要的氧气；在培养基中加入300-350毫升豆油作为消泡剂，以消除在搅拌过程中产生的气泡。发酵96-120小时菌株数量可达IO9个/毫升。其深层发酵的发酵液制备生防制剂，是将假单胞菌Pseudomonas sp. P4-11菌株的发酵液，添加生长营养元素后，制成生防菌株制剂，于常温保存，该生长营养元素包括硫酸铵0. 15-0. 19克，硫酸锌0. 4-0. 54克，磷酸钙0. 3-0. 59克，硝酸钾0. 82-0. 92克，过磷酸钙0. 2-0. 33克，硫酸铁0. 10-0. 12克；硼酸、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜分别为0. 0006克；生防菌株发酵液1000mL。菌株制剂外观为淡黄色液体，活菌数量达IO9个/毫升。使用南极假单胞菌生防菌株专用生防制剂的制备方法，所制备的生防制剂可有效地抑制或预防尖刀镰孢菌、辣椒疫霉和大丽轮枝菌的植物病原真菌的产生。所制备的生防制剂稀释5-10倍后，用于大棚黄瓜白粉病的防治。 本发明首先提供南极假单胞菌Pseudomonas sp. P4-11为生防菌株,通过液体深层发酵制备，获得生防菌株制剂，并测定其生物活性，为其在农作物病害生物防治技术领域的应用奠定基础。本发明的技术方案如下(I)生防菌株的获得与鉴定该生防菌株来自中国第24次南极科学考察乌拉圭站(S62° 11’ 50.52”，W58° 55. ’ 50. 4”)采集的海冰样品中，采用佐贝尔2216E培养基分离获得，经16S rDNA鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas),命名为Pseudomonas sp. P4-11 (中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记入册编号CGMCC No. 5346)。(2)生防菌株的保存该生防菌株Pseudomonas sp. P4-11是采用试管斜面,于4°C保存。试管斜面保存菌株的制作具体步骤如下培养基蛋白胨3_5g，酵母粉0. 5-lg，琼脂粉15_17g，陈海水150毫升，自来水850毫升，pH值7. 0-7.2。培养基灭菌后，在试管斜面上划线接种Pseudomonas sp. P4-11生防菌株，于10_15°C，培养24-36小时，贮存于4°C。(3)生防菌株发酵种子液的制备该生防菌株的发酵和制备，首先是将菌株接种于种子培养基中，种子培养基组成蛋白胨3-5g，酵母粉0. 5-lg，陈海水150毫升，自来水850毫升，pH值7. 0-7. 2。培养基100-120°C灭菌30-50分钟，冷却后，将试管斜面保存的生防菌株Pseudomonas sp.P4_ll接种到500毫升三角瓶中(含300毫升培养基)，于10-15°C，150转速/分钟振荡培养24-48小时后，得发酵种子液。(4)生防菌株深层发酵液的制备在获得发酵种子液的基础上，准备深层发酵培养基麸皮5_6g，酵母粉3g_4g，陈海水150毫升，自来水850毫升。100升发酵罐，装70升培养基，灭菌后pH值为7. 0-7. 2。按5-7%质量百分数将Pseudomonas sp. P4-11种子液接种于发酵罐内的深层发酵培养基，通过空气压缩机向罐内通入压缩空气，以提供发酵过程中需要的氧气，罐内压力控制在0.02Pa ;发酵温度保持在13 土 1°C，管内温度通过低温冷冻循环机控制；加入300-350毫升灭菌的豆油作为消泡剂来消除在搅拌过程中产生的气泡。搅拌速度为220-250转/分，发酵96-120小时。由此可得到70L菌株数量为IO9个/晕升的发酵液。(5)生防菌株制剂的制备将假单胞菌Pseudomonas sp. P4-11菌株的发酵液适当添加生长营养元素后，制成菌株生防制剂，该制剂可于常温保存。制剂外观为淡黄色液体，活菌数量达IO9个/毫升。
(6)生防菌株制剂对植物病原的抑制作用的分析方法和应用效果植物病原以真菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)等常见病原菌为指示菌。将植物病原真菌接种于PDA固体培养基，25°C培养48小时后，取一块菌丝体，加至含无菌水的试管中充分振荡，用两层灭菌纱布过滤菌丝后，稀释获得植物病原真菌孢子悬浮液(IO5个/晕升)。采用平板扩散法测定生防菌株制剂抑菌活性。将PDA培养基融化后冷却至45°C，以1: 100 (v/v)倒入各种植物病原真菌的孢子悬浮液，混匀后倾注到平皿中，每皿约20毫升。冷却后，用打孔器呈十字形打孔(直径7毫米)；再用冷却至适当温度的PDA培养基封底，将生防制剂以清水适当稀释后，每孔加入50微升，于22°C培养48小时后，测量抑菌圈大小。结果表明假单胞菌Pseudomonas sp. P4-11对尖刀镰孢菌、辣椒疫霉、大丽轮枝菌等植物病原真菌的抑菌直径在19-34毫米，为强抑制作用。(7)生防菌株制剂的应用将生防菌株制剂以清水适当稀释后，用喷雾器对农田或大棚栽培的果蔬施药，将药液均匀喷施于黄瓜植株全株，可获得68. 26%的防治效果。本发明的一种南极假单胞菌生防菌株是分离于南极海泥或海冰中，经分子鉴定确定为假单胞菌属，是取自极地极端环境的南极菌株。该菌株属于能产生多种抗菌物质的假单胞菌属。将该菌株保存后进行深层发酵，可有效地对农作物病害进行生物防治，制备可用于防治农业果蔬植物病害的生防制剂具有广泛的应用前景。本发明的特点在于1.首次以南极假单胞菌(Pseudomonas)属作为果蔬病害的生防菌株,并建立该菌株的100L体积发酵罐的发酵工艺。2.提供了南极假单胞菌Pseudomonas sp. P4-11的潜在用途抑菌实验表明，生防菌株制剂对多种植物病原具有抑制作用；对大棚黄瓜黄瓜白粉病的防治效果达68. 26%,与I %武夷菌素水剂500倍稀释液63. 71%的防效相当。说明本发明中的菌株在植物病害的无公害生 物防治中具有潜在的应用前景。



南极假单胞菌生防菌株是从南极海冰或海泥中分离获得海洋细菌，分子鉴定为假单胞菌Pseudomonas属，命名为Pseudomonas sp.P4-11。利用该菌株制备生防制剂具有方法简单、活性独特、功能奇特、农用药效价值大，降解有毒物质等特点。采用液体深层发酵等科学的试验手段，首创性的从海冰或海泥中获得假单胞菌生防菌株，实现了获取和保存假单胞菌生防菌株的方法，开创了假单胞菌生物农药综合利用，预防和抑制农作物病虫害，自然资源得到开发和利用，降低了成本，提高了社会和经济效益。从海冰微生物获得假单胞菌是生物农药技术的重大突破，为研究开发防止农作物污染和确保食品源安全的农药产品奠定了基础。