专利名称：狂犬病病毒的纯化方法狂犬病病毒的纯化方法本发明的目的是一种纯化从细胞培养物得到的狂犬病病毒的方法。通常，从经感染的细胞培养物得到的病毒收获物不仅含有所希望的病毒，而且还含有细胞的蛋白质和DNA，其是应当除去的杂质。因为病毒负责大量的细胞裂解和/或病毒收获物很晚才取得，所以盐析的细胞蛋白质和DNA的量就更加大。除了细胞级的杂质外，其中存在经感染细胞的培养基的蛋白质也是在施行该病毒纯化方法时力图去除的杂质。在病毒用于疫苗生产时，力图得到尽可能纯的制剂，以避免针对蛋白质杂质的过敏反应的发展。在一些国家，存在这样的法律，其限定在含有从连续细胞系得到的产物的疫苗中IOOpg/疫苗剂量，甚至更低的所准许的最大细胞DNA量。在现有技术中已经描述过纯化狂犬病病毒的不同方法。US 4 664 912描述了在用β -丙酸内酯使其失活后通过区带离心法纯化狂犬病病毒的方法。另一种方法在于，当待纯化的病毒收集物的体积很大时联用体积排阻色谱法与阴离子交换色谱法。US 4 725 547描述了通过在硫酸cellulofine (硫酸和纤维素的酯)上的亲和层析法来纯化狂犬病病毒的方法。WO 97/06243描述了纯化病毒，特别是纯化来自经感染的Vero细胞的培养物的狂犬病病毒的方法。该方法包括阴离子交换色谱，接着是阳离子交换色谱，最后通过金属螯合亲和色谱完成。在使用这种方法时，通过使用所谓的”总DNA临界值测定”技术，在一个剂量的疫苗中所含的残留DNA的含量彡30-40pg。Kumar Α. P等人在Microbes and Infection ^)05)，7，第 1110-1116页中对从经感染的Vero细胞的培养物的上清液纯化狂犬病病毒的两种方法进行了比较，所述经感染的 Vero细胞在含有胎牛血清的培养基中进行培养。它显示，基于阴离子交换色谱柱(DEAE-琼脂糖CL -6B)的纯化方法表现优于蔗糖梯度区带离心纯化方法，因为在就残留核酸和蛋白质的量而言可比较的纯度等级下，用该色谱方法，狂犬病病毒的得率更好。Frazatti-Gallina N. M.在 “Vaccine” (2004)，23，第 511-517 页中也描述了一种从在无胎牛血清培养基中培养的经感染的Vero细胞的培养物的上清液中纯化狂犬病病毒的方法。该纯化方法在病毒收获物的澄清和浓缩步骤后还采用了在DEAE-纤维素基担体上的阴离子交换色谱法步骤。采用这种方法时，采用印迹杂交技术测量的残留DNA的量为 <23pg/疫苗剂量。因此，当该狂犬病病毒纯化方法包括离子交换色谱法步骤时，几乎总是看到一个阴离子交换色谱法步骤，为的是将含有待纯化病毒的培养基中的核酸保留在这种色谱担体上。一种表现特别好的病毒纯化方法应该能够以最佳方式除去细胞的蛋白质和DNA 杂质，同时保证所纯化狂犬病病毒的最大得率，并且始终存在寻找符合这些标准的新方法的需要。本发明的目的是提供一种符合这些标准的新的纯化方法。本发明的另一个目的是提供一种用于从无动物血清或任何血清蛋白质的病毒收获物纯化狂犬病病毒的方法，更特别地，是提供一种其中仅使用非动物来源产品的纯化方法。为此，本发明的目的是一种狂犬病病毒的纯化方法，它包括唯一的离子交换色谱法步骤，所述步骤是阳离子交换色谱法步骤，根据该步骤a.让被病毒感染的细胞的培养物的上清液(surnageant)与阳离子交换色谱担体接触，该担体含有在其上已通过共价键接枝磺基异丁基基团的聚甲基丙烯酸酯基体，以便这种狂犬病病毒结合在担体上，并在第二步中，b.从其担体上洗脱病毒。根据本发明方法的一个方面，被狂犬病病毒感染的细胞的培养物的上清液没有动物血清或任何血清蛋白质。根据另一个方面，被狂犬病病毒感染的细胞的培养物的上清液没有任何动物来源的外源蛋白质。根据另外一个方面，在被狂犬病病毒感染的细胞的培养物的上清液中非动物来源的外源蛋白质的浓度彡15mg/l。根据另外一个方面，被狂犬病病毒感染的细胞的培养物的上清液没有任何动物来源的外源产品。依照根据本发明的方法的一个实施方案，在与阳离子交换色谱担体进行接触之前，预先使被狂犬病病毒感染的细胞的培养物的上清液澄清。根据本发明的纯化方法的特征在于，在洗脱液中测得的病毒量对应于在已与该色谱担体接触的上清液中测得的病毒量的至少70%。更特别地，根据本发明的纯化方法的特征在于，在洗脱液中测得的总蛋白质量对应于在已与该色谱担体接触的上清液中测得的总蛋白质量的40%以下，并且在该洗脱液中测得的DNA量对应于在已与该色谱担体接触的上清液中测得的DNA量的5%以下，优选地 2. 5%以下，更加优选地1%以下。依照根据本发明的方法的另一个实施方案，在从其色谱担体洗脱该病毒之后，任选地对其进行浓缩，然后用核酸酶进行处理。根据本发明方法的一个方面，该核酸酶是核酸内切酶，例如benzonase。在本发明的另一个实施方案中，随后对该洗脱液进行蔗糖梯度超离心，并且收集含有纯化病毒的梯度级分。在本发明的另一个方面中，随后用病毒灭活剂灭活该纯化的狂犬病病毒。在另一个特别的方面中，所述病毒灭活剂是β-丙酸内酯。根据一个优选的方面，根据本发明方法的所有步骤都是用非动物来源产品来进行的。本发明的目的还在于一种抗狂犬病疫苗的生产方法，其中a)用狂犬病病毒感染细胞培养物，b)根据本发明的方法，从经感染细胞的培养物的上清液开始来纯化狂犬病病毒，c)让在b)中得到的纯化病毒的悬浮液在储存缓冲液中进行混合，以及d)把在c)中得到的混合物以单剂量或多剂量疫苗剂型进行分配。根据另一个方面，本发明涉及一种抗狂犬病疫苗的生产方法，其中a)用狂犬病病毒感染细胞培养物，
b)根据本发明的方法，从经感染细胞的培养物的上清液纯化狂犬病病毒，
c)让在b)中得到的经纯化病毒的悬浮液在冻干缓冲液中进行混合，
d)把在c)中得到的经纯化病毒的悬浮液以单剂量或多剂量疫苗剂型进行分配，以及
e)对这些疫苗剂进行冻干。最后，本发明的目的在于含有纯化的并灭活的狂犬病病毒的疫苗，其特征在于，存在于有效剂量(根据NIH检测，在含有2. 5UI的疫苗剂量中)疫苗中的用定量PCR测定的残留DNA的量与用Bradford法测定的总蛋白质的量分别小于20pg与40μβ，优选地小于IOpg 与 20μδο根据另一个方面，包含在有效剂量疫苗中的总蛋白质的至少70%是狂犬病病毒的蛋白质。最后，优选地，根据本发明的疫苗没有任何动物来源的外源产品。发明详述
本发明的狂犬病病毒纯化方法包括唯一的离子交换色谱法步骤，所述色谱法步骤是阳离子交换色谱法步骤。当然，在本发明的范围内，该狂犬病病毒的纯化方法不限于唯一的色谱法步骤，而可以包括一个或多个其它额外步骤，在这些步骤不是离子交换色谱法步骤的情况下。与现有技术所考虑的不同，本发明人已证明，其担体含有在其上已通过共价键接枝磺基异丁基基团的聚甲基丙烯酸酯基体的阳离子交换色谱的性能优于阴离子交换色谱的性能。不受理论的约束，看来这种狂犬病病毒具有正的和负的双重极性，这允许其同时结合在阴离子交换剂担体(DEAES)和阳离子交换剂担体(SO3-型)上。相对于在色谱担体的负载量限度内与该色谱担体接触的病毒和DNA的起始量，基于该洗脱液中测得的狂犬病病毒和DNA的量来计算在本发明的范围内的“色谱法性能”。对于相等量的已与该色谱担体接触的病毒和DNA，在洗脱液中测得的病毒的量越大，并且残留DNA的量越低，则色谱担体的性能越好。借助有利于该狂犬病病毒与阳离子交换剂相互作用的柔软聚合物链，将磺基异丁基基团接枝在聚甲基丙烯酸酯基体上。优选地，该聚合物链包括具有下式的单体单元链段


本发明的目的是一种纯化狂犬病病毒的方法，它包括唯一的离子交换色谱法步骤，所述步骤是阳离子交换色谱法步骤，其中A、让被病毒感染的细胞的培养物的上清液与阳离子交换色谱担体接触，该担体含有接枝磺基异丁基基团的聚甲基丙烯酸酯基体，以便让狂犬病病毒结合在担体上，以及，B、从其担体上洗脱该病毒。