专利名称：一种新的l-山梨糖脱氢酶基因及其编码的蛋白质的制作方法 维生素C又名L-抗坏血酸，是人体营养必需的水溶性维生素，在医药、日用化工和食品工业中应用广泛。维生素C的工业化生产早期主要采用Reichstein等人发明的所谓“莱氏法”(Helvetica chimica Acta，第17卷，311页，1934年)。该法以D-葡萄糖为原料，经过加氢得到D-山梨醇，然后由微生物转化为L-山梨糖，再经过几步化学反应产生2-酮基-L-古龙酸。该法工艺路线成熟，产品质量较好，转化率高，但工艺路线较长，不易连续操作，而且使用大量易燃易爆有毒的化学品，既危险又污染环境。20世纪60年代以来各国开展了以微生物转化取代莱氏法工艺的研究，先后提出了多条路线，其中尹光琳等开发的二步发酵法工艺最早应用于工业化大规模生产(美国专利4935359，1900年)，目前仍为维生素C的主要生产路线。该二步发酵法第一步是利用醋酸菌将D-山梨醇转化为L-山梨糖，然后在一种混合菌系的作用下由L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸。在这种混合菌系中，起糖酸转化作用的微生物最初被定名为氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans)，近来经系统鉴定对其分类位置重新进行了确定，该菌被更名为普通生酮基古龙酸菌(拉丁名为Ketogulonigenium vulgare，见International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology，第51卷，1059页，2001年)。众所周知，葡萄糖杆菌具有代谢山梨醇产生2-酮基-L-古龙酸的能力。Makover等提出了生黑葡萄糖杆菌(Gluconobacter melanogenus)山梨醇代谢的生化途径(Biotechnology and Bioengineering，第17卷，1975年)。D-山梨醇在山梨醇脱氢酶的催化下转化为L-山梨糖，后者在山梨糖脱氢酶和山梨酮脱氢酶的作用下依次氧化为山梨酮和2-酮基-L-古龙酸。该途径就是所谓的山梨酮途径。Niwa等从氧化葡萄糖杆菌T-100分离得到山梨糖脱氢酶和山梨酮脱氢酶基因(美国专利6197562)。本发明的研究结果证明，在具有较强糖酸转化能力的普通生酮基古龙酸菌中，山梨糖的转化也经过山梨酮的中间产物，但参与催化的有关酶与上述葡萄糖杆菌中的山梨糖脱氢酶和山梨酮脱氢酶是完全不同的。编码这种酶的基因在国内外文献未见报道，为一种新的分子，它不与已知其它功能相关基因同源。
现在的维生素C工业化大规模生产工艺主要是二步发酵法。为简化维生素C的生产工艺，本发明公开了一种新的基因。它具有如序列表中序列1所示的DNA序列，其编码的蛋白质具有如序列表中序列2所示的氨基酸序列，该蛋白质能够将山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸。本发明所制备的基因序列还包括在严格条件下与序列表中序列1杂交的DNA序列。本发明所述基因编码的蛋白质的氨基酸序列还包括将序列表中序列2的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加而成并且具有将山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸活性的氨基酸序列。本发明的基因可通过下列方法得到。首先是普通生酮基古龙酸菌的培养与收集及其文库构建。普通生酮基古龙酸菌经过培养，离心收集菌体，洗涤后得到普通生酮基古龙酸菌菌体。按常规方法提取细菌染色体DNA，经部分酶切后分离片段，与酶切的粘粒载体进行连接，将连接产物用包装蛋白包装，转染大肠杆菌，得到转化子。
然后是山梨糖脱氢酶纯化及其体外转化作用。将普通生酮基古龙酸菌的菌体重悬，超声破碎，离心，得到裂解液。加硫酸铵，离心收集沉淀，透析。透析液经层析柱纯化，紫外检测收集含有对DCIP具有脱色作用的组分。透析，再经层析纯化，收集活性组分，透析。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。在容器中加入山梨糖和山梨糖脱氢酶，混合后反应，通过薄层层析和高效液相色谱检测转化产物。结果转化产物中有2-酮基-L-古龙酸存在。
山梨糖脱氢酶抗血清制备。将纯化的糖酸转化酶加入弗氏不完全佐剂，免疫家兔。采样检测效价，抗血清达到较高滴度后从心脏采血，分离血清，分装，于-20℃保藏。
山梨糖脱氢酶基因分离和序列分析。通过Dot-ELISA的方法筛选文库。将文库的单个克隆培养扩增，裂解，上清液点涂硝酸纤维素膜，包被，封闭，滴加稀释的兔抗山梨糖脱氢酶抗血清，洗膜，滴加生物素羊抗兔IgG，温育，洗膜，滴加SABC，温育，洗膜，滴加DAB显色。从上述文库中筛选得到阳性克隆。提取阳性克隆的重组粘粒，酶切，收集片段，与酶切的克隆载体连接，转化大肠杆菌，再用上述Dot-ELISA方法筛选亚克隆文库，从获得的转化子中筛选得到阳性克隆，从各阳性克隆提取质粒，分析插入片段大小，选取插入片段较小的阳性克隆，提取质粒，测序。序列分析结果显示，其中包含一个1839bp大小的读框(见序列表序列1)，BLAST搜索结果表明，该序列为一从未公开过的新基因。
山梨糖脱氢酶基因在大肠杆菌中表达。以普通生酮基古龙酸菌的染色体DNA为模板，通过PCR方法扩增，酶切PCR产物，连接至pQE60，转化至大肠杆菌，经过抗生素筛选转化子，再用PCR和活性分析方法进一步筛选表达山梨糖脱氢酶的阳性克隆。SDS-PAGE、体外转化、酶活测定等分析结果表明，所得阳性克隆表达产物与普通生酮基古龙酸菌和上述亚克隆产生的山梨糖脱氢酶一致。证明普通生酮基古龙酸菌的山梨糖脱氢酶确系由序列1编码。
本发明的基因编码的蛋白质，即山梨糖脱氢酶含618个氨基酸残基(氨基酸序列见序列表中的序列2)，分子量为66.4kD，等电点为4.3。BLAST检索结果显示，与该序列同源性最高的蛋白质是生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)的乙醇脱氢酶，两者氨基酸序列同源性为52％。研究证明，普通生酮基古龙酸菌的山梨酮脱氢酶亦为醌蛋白，其生物学活性依赖辅酶吡咯并喹啉苯醌(PQQ)。
山梨糖脱氢酶在维生素C工业化生产中具有重要价值，因此编码此酶新基因的发现对于维生素C生产工艺的改进具有重要的意义。

实施例一、普通生酮基古龙酸菌的培养、收集及其文库构建扩增普通生酮基古龙酸菌的培养基为山梨糖15g，酵母膏5g，玉米浆3g，蛋白胨5g，尿素4g，葡萄糖2g，硫酸镁0.2g，碳酸钙4g，磷酸二氢钾5g，加去离子水至1升，pH6.8，115℃灭菌。从普通生酮基古龙酸菌的斜面上接种至上述培养基，30℃，250转/分振荡培养48小时，再按6％接种量转接至含相同培养基的5升发酵罐上扩大培养，8000转/分离心15分钟收集菌体，用适当缓冲液洗涤一次，即得普通生酮基古龙酸菌菌体。
按常规方法提取普通生酮基古龙酸菌的染色体DNA，经Sau3AI部分酶切后分离30kb左右的片段，与经HpaI和PstI酶切的粘粒载体pSY1进行连接，将连接产物用包装蛋白包装，转染大肠杆菌DH5cα，得到转化子20000余个。
实施例二、山梨糖脱氢酶基因分离和序列分析通过Dot-ELISA的方法筛选文库。将文库的单个克隆用LB培养基扩增，用溶菌酶裂解，上清液点涂在硝酸纤维素膜上，包被，封闭，滴加稀释的兔抗山梨糖脱氢酶抗血清，洗膜，滴加生物素羊抗兔IgG，温育，洗膜，滴加SABC，温育，洗膜，滴加DAB显色。阳性对照呈现明显的褐色斑点。结果从上述文库中筛选得到1个阳性克隆。提取该阳性克隆的重组粘粒，经Sau3AI部分酶切，收集大小为3～5kb的片段，与经过BamHI酶切并用碱性磷酸酶去磷酸化的pUC18连接，转化DH5α，再用上述Dot-ELISA方法筛选亚克隆文库，从获得的1000余个转化子中筛选得到数个阳性克隆，从各阳性克隆提取质粒，分析插入片段大小，选取插入片段较小的阳性克隆，提取质粒，测序，得到外源插入片段长度为5325bp的DNA序列。序列分析结果显示，其中包含一个1839bp大小的读框(见序列表序列1)，BLAST搜索结果表明，该序列为一从未公开过的新基因。该基因编码含618个氨基酸的残基的蛋白质(见序列表序列2)，分子量为66.4kD，等电点为4.3。BLAST搜索结果显示，与该序列同源性最高的蛋白质是生糖酮假葡萄糖酸杆菌(Pseudogluco-nobacter saccharoketogenes)的乙醇脱氢酶，两者氨基酸序列同源性为52％。研究证明，普通生酮基古龙酸菌的山梨酮脱氢酶亦为醌蛋白，其生物学活性依赖辅酶吡咯并喹啉苯醌(PQQ)。
实施例三、山梨糖脱氢酶基因在大肠杆菌中表达以普通生酮基古龙酸菌的染色体DNA为模板，以序列5’catgccatggcgcaaaatgt catagcgtca g 3’和序列5’gaagatctgt atccgccctt attgcgg 3’为引物通过PCR方法扩增得到1.9kb产物，用NcoI和BglII双酶切。同时提取质粒pQE60，用同样两种内切酶切开，用T4 DNA聚合酶与上述PCR扩增片段连接，转化至大肠杆菌M15，在含50μg/ml卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，再用PCR和活性分析方法进一步筛选表达山梨糖脱氢酶的阳性克隆。SDS-PAGE、体外转化、酶活测定等分析结果表明，所得阳性克隆表达产物与普通生酮基古龙酸菌和上述亚克隆产生的山梨糖脱氢酶一致。证明普通生酮基古龙酸菌的山梨糖脱氢酶确系由序列1编码。
实施例四、表达产物山梨糖脱氢酶的纯化及其体外催化作用将普通生酮基古龙酸菌的菌体重悬于10mmol/L pH7.0之磷酸缓冲液中，超声破碎30分钟，16000转/分离心60分钟，得普通生酮基古龙酸菌的裂解液130ml。于冰水浴上在磁力搅拌下，向上述裂解液中加研磨过的硫酸铵使达30％饱和度。15000r/min离心30min收集所得沉淀，透析。透析液上样至DEAE Sepharose Fast Flow柱进行纯化，用UV280检测收集含有对DCIP具有脱色作用的组分。透析，再上样至Q Sepharose High Performance(PharmaciaBiotech)分离柱上，用含1mol/L NaCl的25mmol/L Tris-HCl pH8.0进行梯度洗脱，同上述方法收集活性组分，透析。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化产物为一条带，分子量约为66kD。
在1.5ml Eppendorf管中加入25mmol/L Tris-HCl pH8.0 Tris-HCl缓冲液0.2ml，0.625mol/L山梨糖0.2ml，PMS 6mg，1mg/ml PQQ 0.01ml，山梨糖脱氢酶0.2ml，去离子水0.4ml，混合，置30℃反应4小时，通过薄层层析和高效液相色谱检测转化产物。结果转化产物中有2-酮基-L-古龙酸存在。
实施例五、山梨糖脱氢酶抗血清制备将上述纯化的糖酸转化酶(蛋白含量为0.5mg/ml)经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，将含2mg纯化蛋白的滤液加入弗氏不完全佐剂，在体重为2.5千克的家兔背部皮下注射免疫家兔。10天后同法加强注射一次，采样检测效价，抗血清达到较高滴度后从心脏采血，分离血清，分装，于-20℃保藏。
序列表<110>军事医学科学院生物工程研究所<120>L-山梨糖脱氢酶基因及其制备方法<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1839<212>DNA<213>
<400>1gtgacgcaaa atgtcatagc gtcagattgt cgcacgtgct gcggcggtgc agcattggcc 60ccgggagggt ggccgctgca ccaacccatc tggaggacag agatgaaacc gacttcgctg 120ctttgggcca gtgctggcgc acttgcattg cttgccgcac ccgcccttgc ccaaaccgcc 180atcaccgatg aaatgctggc gaacccgccc gctggtgaat ggatcaacta cggtcagaac 240caagagaact accgccactc gcccctgacg cagattaccg cagacaacgt cggccaactg 300caactggtct gggcgcgcgg tatggaagcg ggcaagatcc aagtgacccc gcttgtccat 360gacggcgtca tgtatctggc aaaccccggt gacgtgatcc aggccatcga cgccgcgacc 420ggcgatctga tctgggaaca ccgccgccaa ctgccgaaca tcgccacgct gaacagcttt 480ggtgagccga cccgcggcat ggccctctat ggcaccaacg tctatttcgt ctcgtgggac 540aaccacctgg tcgcgctgga catgggcacc gggcaagtcg tgtttgacgt cgaccgcggt 600cagggtgatg agcgcgtctc gaactcgtcg ggcccgattg tcgccaatgg caccatcgtc 660gccggttcga cctgtcagta ttcgccgttc ggctgctttg tctcgggcca cgattcggcc 720accggcgaag agctgtggcg caactacttt atcccgcgcg caggcgaaga gggtgatgag 780acctggggca atgattacga gtcgcgctgg atgaccggtg cctggggcca gatcacctat 840gaccccgtca ccaaccttgt ccactacggc tcgaccgctg tgggtccggc gtcggaaacc 900caacgcggca ccccgggcgg cacgctgtac ggcacgaaca cccgtttcgc cgtgcgtcct 960gacacgggcg agattgtctg gcgtcaccag accctgcccc gcgacaactg ggaccaggaa 1020tgcacgttcg agatgatggt caccaatgtg gatgtccaac cctcgaccga gatggaaggt 1080ctgcagtcga tcaacccgaa cgccgcaact ggcgagcgtc gcgtgctgac cggcgttccg 1140
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<400>2Met Thr Gln Asn Val Ile Ala Ser Asp Cys Arg Thr Cys Cys Gly Gly1 5 10 15Ala Ala Leu Ala Pro Gly Gly Trp Pro Leu His Gln Pro Ile Trp Arg20 25 30Thr Glu Met Lys Pro Thr Ser Leu Leu Trp Ala Ser Ala Gly Ala Leu35 40 45Ala Leu Leu Ala Ala Pro Ala Leu Ala Gln Thr Ala Ile Thr Asp Glu50 55 60Met Leu Ala Asn Pro Pro Ala Gly Glu Trp Ile Asn Tyr Gly Gln Asn65 70 75 80Gln Glu Asn Tyr Arg His Ser Pro Leu Thr Gln Ile Thr Ala Asp Asn85 90 95
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本发明公开了一种新的L－山梨糖脱氢酶基因及其编码的蛋白质。该基因具有序列表中序列1所示核苷酸序列，所编码的蛋白质具有序列表中序列2所示的氨基酸序列。该编码蛋白具有维生素C工业化生产中的山梨糖脱氢酶和山梨酮脱氢酶的作用，对于简化维生素C的生产工艺具有重要的意义。