专利名称：转移螺旋藻遗传物质改良禾本科粮作物的方法
本发明要解决的技术问题是，通过生物技术途径向禾本科粮食作物转移螺旋藻的遗传物质，创造新种质，培育出产量高、营养更丰富的粮食作物新品种。本发明的技术方案，即所述转移螺旋藻遗传物质改良禾本科粮作物的方法是(1)螺旋藻基因组总DNA的提取；(2)螺旋藻DNA导入禾本科物种的植株；(3)选择、鉴定变异株；(4)系统选育方法或其他常规育种方法选育新品种、品系；所述螺旋藻是指钝顶螺螺旋藻、极大螺旋藻。以下对本发明做出进一步说明。本发明所述禾本科粮作物包括水稻、小麦、玉米、高梁。采用已有技术常用方法提取螺旋藻总DNA。本发明采用已有技术的“花粉管通道法”、“穗茎注射法”和“浸泡法”等外源DNA导入方法将螺旋藻基因组总DNA直接导入禾本科物种的受体植物(而不是通过原生质体途径和基因工程技术)，实现螺旋藻遗传物质向禾本科物种的转移，创造出变异系，并培育出作物新品种、品系。本发明所述选择、鉴定变异株的一般方法和规则是主要于始穗后，对导入螺旋藻总DNA的第1代(D1)群体中(300-5000株不等)的每1单株，与群体其他单株进行性状比较，重点观察在株高、熟期、剑叶长度、分蘖能力、穗粒结构和外观品质等方面性状的差异，选择出分蘖力增强、剑叶更长、穗粒变大或品质较优的变异株。本发明所述选育新品种、品系的系统选育方法和育种方法的一般规则是D1发现在上述1个或多个性状上明显与群体其他单株不同的单株，单独收种。后代按已有常规育种方法进行种植、选育通过系统选育，选择仍然具有原始变异株具有的优良变异性状(分蘖力强、剑叶长、穗粒大、品质优等)的株系，直至稳定；同时，根据变异系的性状特点，从第2代起，从变异系中选择优良单株，与性状互补的生产上大面积应用品种或育种中间材料进行杂交(或复交、回交等)，从杂交后代中选择出产量与品质性状获得改良的新品系。螺旋藻(Spirulina spp.)在分类上属于蓝藻门(Cyanophyta)颤藻目(Oscilatoriales)颤藻科(Oscilatoriaceae)螺旋藻属(Spirulina)。这个属全世界已知有36个种，如在国内外可工厂化生产的2个种钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)和极大螺旋藻(Spirulina maxima)。
螺旋藻是具有在低光强条件下高光效特性与高营养与保健价值的生物。由于螺旋藻不仅光能利用率是水稻的5倍以上，而且是低光强下的高光效；不仅其干粉的蛋白质含量高达68％，而且其氨基酸组成十分合理，如富含赖氨酸、脯氨酸等；另外，螺旋藻还含有许多其他有益于人体健康的元素。因此，我们设计将螺旋藻的这些优良遗传特性转移到禾本科粮食作物中，培育出更高产、更营养的粮食作物。
但螺旋藻与禾本科物种间不能够进行有性杂交。要达到上述设计目的，必须解决螺旋藻遗传物质向禾本科物种的转移问题。我们设计通过适当生物技术方法来解决这一问题。
螺旋藻与水稻在生物分类上属于不同的“门”，亲缘关系很远。显然，通过常规杂交方法是不能达到研究目的的；同时，螺旋藻本身是无细胞壁的单细胞生物，二者间原生质体融合是可能的，但非常困难；用现代基因工程技术将动物或微生物的基因转移到植物基因组已不是什么难事，但转移螺旋藻的基因首先需要克隆目的基因，且目前基因工程主要是单一基因的转移。而根据比较基因组学研究最新进展，两个在表型上风马牛不相及的不同物种间的遗传物质具有同源性，同源DNA片段之间就可能发生“杂交”；因此，本发明采用通过转移含有螺旋藻所有基因的基因组总DNA的途径，将螺旋藻(多个)有利性状基因转移到禾本科作物。
利用C4植物种质资源可能大大提高水稻等C3作物的光合效率，达到提高产量潜力的目的。同时，由于C4植物只在高光温与干旱条件下才表现比C3生物高的光合速率，不少科学家认为“C4水稻”可能只对高温、高光强及干旱等生态条件下的水稻生产才有重要意义。而增强作物低光温气候(包括阴雨天气及晴天早晨与傍晚)，特别是增加其生长中后期群体中、下部叶片(低光强环境)的光合效率，对于减少作物群体内部单株间的相互屏蔽或增加群体内部单株的耐阴性，增大单位面积作物(如水稻、小麦)的穗容量，提高作物单位面积群体低光强条件下的光能利用率，提高相应生态与气候条件下作物的产量潜力，可能更为有效。而且本发明在提高作物产量潜力的同时，试图利用同一远缘物种来改善粮食作物的品质特性，甚至协同提高其对病虫的抗性一举多得，这是有别于利用背景技术开展的其他研究的，技术效果也大大不同。
本发明采用的技术路线是直接将螺旋藻总DNA导入受体植物的方法。这一技术路线相对别的背景技术，如原生质体融合技术和基因工程技术，在操作上十分简单(如不需要组织培养过程)；尤其重要的是，本发明通过对(采用这一方法将野生稻、稗草的基因组总DNA导入栽培稻获得的)变异系及其原始供受体间在RAPD、SSR、AFLP标记及特异DNA片段核苷酸序列的遗传多态性的研究发现采用外源总DNA直接导入受体植物获得的变异系与受体间存在约5％的遗传多态性，且变异系确实获得了来源于供体特异(受体植物没有)的大片段DNA。也就是说，本发明采用更为简单的技术，能够协同转移供体多个基因，实现对受体的综合改良。
看到螺旋藻在光合作用与营养品质方面的优异特性，且能够与禾本科粮食作物的品种改良联系起来开展研究，并取得与预期结果吻合的研究成果这在研究思路上、技术路线及结果(参见


图1至图6)上均是背景技术之所未及的。
本发明将钝顶螺旋藻基因组DNA分别通过“花粉管通道法”、“穗茎注射法”导入先恢207、盐恢559(R559)、蜀恢527(R527)等等多个水稻品系植株中，从第1代群体均鉴别出变异株。来自螺旋藻基因组总DNA导入的变异系多表现分蘖能力增强、剑叶叶片长度比受体植物长、穗与籽粒变大、籽粒充实更饱满或品质更优等特点。这里特别例举从盐恢559(R559)、蜀恢527(R527)的D1群体中分别选择到的1株优良变异株V559及V527。
V559及V527相对原始品种具有剑叶更长直、颜色更深绿，分蘖增强，穗粒变大以及外观品质更优等特点。在V559及V527的第2、3代群体中存在许多仍然具备这些特点的植株，说明原始变异株的优良遗传与变异特性可以遗传下来。具体而言，盐恢559稻米存在明显心腹白，而V559及其后代部分植株不仅分蘖能力增强，而且米粒完全没有心腹白或心腹白变小；蜀恢527籽粒充实欠饱满，而V527及其后代绝大部分植株分蘖增强、每穗粒数增加、谷粒充实饱满。蜀恢527及V527第2代群体各5个典型单株株考种结果(平均值)如下表表1变异系与原始品种蜀恢527产量性状考种表材料名称有效穗数 每穗总粒数 每穗实粒数 结实率(％) 千粒重(g)蜀恢52710108 78 72 30变异系 13148 137 93 31在水稻中转移螺旋藻基因组DNA能够到达我们技术设计的目的，我们推测同样可以利用螺旋藻来改良其他禾本科粮食作物。因为，其他禾本科植物与螺旋藻的亲缘关系与水稻和螺旋藻的亲缘关系的远近没有明显差异；利用上述3种外源DNA直接导入受体植物的方法在小麦、玉米和高粱中转移其他物种基因组DNA均有成功报道，在技术上是成熟的(且与在水稻中的技术大同小异)。
由以上可知，本发明为转移螺旋藻遗传物质改良禾本科粮作物的方法，它可显著提高作物产量潜力，改善品质。
图1是蜀恢527(左)及导入螺旋藻DNA获得的变异株V527(右)；图2是蜀恢527(左)及导入螺旋藻DNA获得的变异株V527的第2代典型单株(右)；图3是蜀恢527的1典型单株(左)和变异株V527的第2代1典型单株(右)的稻穗；图4是盐恢559(左)及导入螺旋藻DNA获得的变异株V559(右)；图5是盐恢559(左)及导入螺旋藻DNA获得的变异株V559的第2代典型单株(右)；图6是盐恢559群体(左、感穗颈瘟)和变异株527的第2代群体(右、抗稻瘟病)。

实施例11)螺旋藻基因组DNA的提取(DNA提取是常规技术，这里只例举我们采用的1种方法)培养、收集钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)的鲜活藻泥10g，加15ml提取液(Tris-Cl PH8.0 100mmol/L；NaCl500mmol/L；EDTA PH8.0 50mmol/L；SDS 1.5％)及25μl巯基乙醇。混匀后65℃水浴30min，加5mol/L KAc 5ml，冰浴10分钟。用等体积氯仿/异戊醇(V/V＝24/1)抽提，8000rpm离心15min，取上清加等体积的异丙醇(-20℃预冷)，静置2h，挑起DNA线团，70％酒精洗涤晾干，TE溶解。0.8％琼脂糖凝胶电泳，测定浓度，-20℃保存备用。
2)通过“花粉管通道法”、“穗茎注射法”和“浸泡法”3种方法导入螺旋藻基因组DNA(这是常规技术，这里只例举我们采用的方法)“穗茎注射法”选取发育至适当时期的适当水稻品种、品系的稻穗(具体为水稻孕穗期的第6期)，用微量进样器注射50μl螺旋藻DNA溶液(浓度300μg/ml)入穗颈节下第1节间，开花前套袋，收种(即为第l代种子)。
花粉管通道法选取开花后1-3h的颍花，剪掉部分颍壳及柱头，用微量进样器滴注5-10μl DNA溶液(DNA溶于1×SSC溶液中，浓度300μg/ml)，套袋，收种。
浸泡法水稻种子去壳，室温浸种8h，常规灭菌，DNA溶液(溶于0.1×SSC溶液，浓度300μg/ml，含20％的二甲基亚砜)浸泡4-6h，催芽。
3)变异株的选择种植第1代植株共约300-5000株(因为变异率较低，以群体较大为好)，并于全生育期，特别是始穗期后观察、选择变异株(在生育期、株高、株叶型穗粒结构等性状上与群体中其他单株有明显的不同)。导入螺旋藻DNA出现的变异株倾向于分蘖能力比受体增强，剑叶比受体剑叶长这可视为观察和选择原始变异株及其后代株系的重要经验。前人及我们的大量研究表明，第1代的变异率一般为0.1％-1％。单独收取变异株全部种子。
4)新品系的选育(这一步骤完全与常规育种方法一致，不详细说明)按株系种植变异株后代，并通过系统选育或(和)其它常规育种方法加以选育，直至选育出稳定遗传的理想株系。


本发明为转移螺旋藻遗传物质改良禾本科粮作物的方法，该方法是(1)螺旋藻基因组总DNA的提取；(2)螺旋藻DNA导入禾本科物种的植株；(3)选择、鉴定变异株；(4)系统选育方法或其他常规育种方法选育新品种、品系；所述螺旋藻是指钝顶螺螺旋藻、极大螺旋藻。本发明实现了螺旋藻遗传物质向禾本科物种的转移，由此创造出变异系，培育出产量高、品质优的作物新种质。