专利名称：高产维生素k2的乳酸乳球菌菌株的制作方法乳酸菌(LAB)广泛用于乳品行业中生产不同的动物奶发酵产品，诸如例如，酸奶或奶酪，并已达到“一般认为安全(GRAS)”的状态。研究证明，一些乳酸菌产生维生素K2。对于发酵奶而言，这些细菌合成的维生素K2的量通常在29至90 ii g/L (Morishita等，1999)维生素K对于人/动物的很多健康问题诸如骨骼健康是很重要的。自然界中，维生素K以两种形式存在，绿色植物中的Kl(叶绿醌)，和很多细菌中的K2(甲基萘醌类(menaquinone),MK)。根据侧链的长度可将MK进一步分类(MK_n,其中n代表异戍二烯基侧链单元的数目)。乳酸菌乳酸乳球菌和乳酸明串珠菌是维生素K2的天然生产者(Morishita等，1999)，虽然产量水平一般比较低。维生素K2是细菌质膜的成分，在质膜中维生素K2作为呼吸链的重要组分传递电子。存在第三种合成维生素K，即K3(甲萘醌(menadione))。维生素K的主要膳食来源是来自蔬菜和油类的Kl。已显示Kl的最高浓度来自绿叶蔬菜-例如菠菜(Kamao等，2007)。鱼和动物中也有少量Kl。K2没有Kl分布广泛，但是可在肝和发酵食品例如枯草芽孢杆菌发酵的纳豆中发现大量K2 (Sato等，2001)。乳制品也含有K2。在一篇日本的研究中，发现乳脂和奶酪中的MK-4含量分别是8 u g/100g和5u g/100g(Kamao等，2007)。在一篇欧洲的研究中，奶酪中MK-8的含量是5-10u g/100g,相同的产品中MK-9的含量是10-20ii g /100g(Shearer等，1996)。注意到在奶酪生产过程中凝乳浓缩了大约10倍，因此大大增加了维生素K2的浓度。在体内，K2的半衰期显著长于Kl，在人体临床试验中，摄入MK-7比摄入Kl对骨骼健康的益处更大(Schurgers等，2007)。维生素K存在于血液中，可用HPLC-MS测量。维生素K是形成蛋白质中的Y-羧基谷氨酸(Gla)残基必需的辅助因子。含有Gla的蛋白质通过结合于钙对凝血和组织钙化发挥重要作用。骨钙素(Oc)是参与骨骼矿化的骨基质蛋白。在该过程中维生素K是辅助因子。Oc依赖于Gla的三个残基，Gla残基的定向帮助Oc紧密结合到钙离子。迄今为止的研究显示Oc在骨骼组织的矿化和重建中发挥重要作用。而且，若干研究已证明，高水平的羧化不全骨隹丐素(ucOc)与低骨矿物质密度和高骨折风险相关(Vergnaud等，1997)。人体研究显示必需的日摄入量应至少为I U g/kg体重(Booth和Suttie, 1998)。这对于有效的血液凝固是足够的，但是研究还显示，对于强健的骨骼健康则需要更多的维生素K。45mg/天的剂量例如高约500倍的维生素K对于绝经后妇女的骨骼健康是有益的(Iwamoto等，2009)。这表明，维生素K具有非常宽的安全范围。应注意到，对于骨骼健康，维生素K2似乎比Kl具有更高的潜力。骨质疏松症是一种代谢骨疾病，特征为低骨量和骨组织的微结构退化，导致骨骼脆性增加并因而骨折风险增加。世界范围内骨质疏松症这一问题都在增加，世界卫生组织(WHO)已预测，在2050年将发生6百万髋部骨折。这导致生活质量和社会成本的大量损失。已证明用Kl和K2作为骨质疏松症的药物治疗绝经后妇女增加了骨矿物质密度，降低了骨折风险(Macdonald等,2008; Vermeer等,2004)。在老年人中，血清中较高的维生素K水平与较低的骨折风险相关(Aliabadi等，2008)。因此，在食品中添加K2应对骨骼健康有益。儿童增加维生素K的摄入尤其有益(van Summeren等,2008)。在体内，维生素K显示对前列腺癌细胞、肝和肠肿瘤以及一些白血病细胞系有抗癌作用(Nimptsch 等，2008; Shearer 和 Newman, 2008; Yokoyama 等，2008)。饮食摄入 K2 而非Kl显示与前列腺癌具有反相关。来自乳制品的维生素K2显示比来自肉类的维生素K2更有效(Nimptsch 等,2008)。饮食摄入K2而非Kl显示降低老年男人和女人中冠心病(CHD)的风险(Geleijnse等，2004)。而且，在另外一个16，000人的研究中，奶酪和凝乳酪中的MK-7、MK-8和MK-9显示对心血管疾病有防 护作用(Gast等，2009)。对该组数据进行进一步评价的结果显示，每增加IOu g K2 (而非Kl)降低心血管疾病风险9%(Beulens等，2009)一般而言，先前已知的野生型LAB产生的维生素K2数量不够高，而不能生产包含维生素K2的商业相关产品——例如维生素K2含量足够高的乳制品。因此，需要另外的、能够产生更多维生素K2的乳酸菌——参见例如W02008/040793A1，也需要维生素K2的含量足够高的食品和药物以有助于满足(对维生素K2的)需要，并且如果必要的话，克服(维生素K2)缺乏。并且，相对于作为纯化的化合物加入的维生素K，更优选内在产生的维生素K2来源，诸如由例如乳酸乳球菌产生的，因为这种来源更具有“天然吸引”，并且产品标签可以更简化，即“简洁标签”。另外，W02008/040784A1描述了可用LAB在一定条件下发酵奶来增加维生素K2产量，所述条件是LAB不是在生长期而是在W02008/040784A1所称的“静息细胞”期(参见例如权利要求1)。这主要是通过向奶中加入相对大量的LAB来获得的。本发明发现在呼吸条件下(在血红素存在下搅拌)生长的细胞产生的维生素K2显著增加。以前，我们已经证明了具有失活的thyA基因(编码胸苷酸合成酶)的菌株产生维生素K2的量大大增加(W02010/139690A1)。虽然该突变株产生维生素K2的量增加，但是它需要专门的条件才能增殖。因此，能够使用标准生产方法来生产的野生型菌株将更加方便。
本发明的目的是提供野生型乳酸菌(LAB)，该细菌能够在标准的发酵条件下产生显著增加量的维生素K2，本发明的目的还在于提供用于生产用于治疗和/或防止维生素K缺乏的维生素K强化的发酵食品或饲料产品以及生产用于治疗和/或防止维生素K缺乏的其他可食用产品例如食品和药物的成本有效并且易实施的方法。本发明的其他目的将在下文中显露，本发明的仍然另外的目的对本发明相关领域的技术人员而言也是显而易见的。为实现上述目的，发明人进行了大量的筛选和研究，鉴定了能够高产维生素K2的新的野生型乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675，从而实现了上述目的。该野生型菌株相对容易操作并且相对容易用于生产大量生物质。该野生型菌株的另一个优点是有可能用作起点来进一步优化维生素K2的生产。因此，本发明的第一个方面涉及高产维生素K2的新的野生型乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675及其突变体和变体，该野生型菌株保藏于德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen),保藏号为 DSM23589。本发明第二个方面涉及生产维生素K2强化的发酵食品或饲料产品的方法，该方法包括:a)用保藏号DSM23589的乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675或其突变体或变体接种合适的基质；b)在有利于维生素K2生产和/或有利于细菌代谢的条件下诸如标准发酵条件下发酵所述基质；c)任选向基质中加入其他微生物和/或添加剂；和d)任选包装发酵的食品或饲料产品。本发明的第三 方面是关于通过实施根据本发明第二方面的方法而获得的维生素K2强化的发酵食品或饲料产品。本发明第四方面涉及包含保藏号DSM23589的乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675及其突变体和变体的发酵食品或饲料产品。本发明第五方面提供一种增加受试者的骨骼强度的非治疗性方法，包括步骤:给予所述受试者根据本发明第三或第四方面的发酵食品或饲料产品。本发明第六方面涉及包含乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675及其突变体和变体的维生素K2强化的乳酸发酵物(ferment)，该发酵物可通过在有利条件下诸如标准发酵条件下发酵乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675及其突变体和变体而获得。本发明第七方面涉及生产维生素K2的方法，包括:a)在有利于细菌代谢和/或有利于维生素K2生产的条件下培养乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675或其突变体或变体；和b)回收生产的维生素K2。本发明第八方面是关于生产维生素K2强化的可食用产品尤其是食品或饲料产品或药物的方法，所述维生素K2强化的可食用产品可用于治疗/或预防哺乳动物的维生素K缺乏。根据一种实施方式，一种此类方法包括:a)向可食用产品、可食用产品的起始材料、或可食用产品的中间制备物中加入根据本发明第六方面的乳酸发酵物和/或根据本发明第七方面的方法生产的维生素K2和/或乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675或其突变体或变体；和b)获得维生素K2强化的可食用产品。本发明第九方面涉及可通过实施本发明第七方面的方法而获得的维生素K2强化的可食用产品。本发明第十方面涉及包含保藏号DSM23589的乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCCl2675及其突变体和变体的可食用产品。本发明第十一方面涉及根据第九或第十方面的可食用产品用作药物。本发明第十二方面涉及根据第九、第十或第十一方面的可食用产品用于在哺乳动物中治疗和/或预防选自以下的疾病:维生素K缺乏、骨质疏松症、癌症诸如前列腺癌以及心血管疾病诸如冠心病。本发明第十三方面涉及乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675用作药物。本发明第十四方面涉及乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675用于治疗和/或预防哺乳动物中选自以下的疾病:维生素K缺乏、骨质疏松症、癌症诸如前列腺癌以及心血管疾病诸如冠心病。本发明其他(多个)方面涉及乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675及其突变体和变体用于生产食品，所述食品用于在哺乳动物中治疗和/或预防维生素K缺乏、骨质疏松症、癌症诸如前列腺癌以及心血管疾病诸如冠心病，本发明还涉及乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675及其突变体和变体用于生产药物，所述药物用于治疗和/或预防哺乳动物中维生素K缺乏、骨质疏松症、癌症诸如前列腺癌以及心血管疾病诸如冠心病。另外，本发明还涉及乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675及其突变体和变体用于治疗和/或预防维生素K缺乏。更具体而言，本发明涉及乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675及其突变体和变体用于治疗和/或预防维生素K缺乏、骨质疏松症、癌症诸如前列腺癌、以及心血管疾病诸如冠心病。另外，本发明还涉及可食用食品用于治疗和/或预防哺乳动物中选自以下的疾病的用途:维生素K缺乏、骨质疏松症、癌症诸如前列腺癌以及心血管疾病诸如冠心病，所述可食用食品包含保藏于德国微生物菌种保藏中心、保藏号为DSM23589的乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675或由其衍生的菌株。 本上下文中，术语“奶”包括动物或植物的奶。奶的例子为牛的奶(牛奶)、骆驼奶、水牛奶、山羊奶、绵羊奶和豆奶。任选地，奶是酸化的，例如通过加入酸(诸如柠檬酸、乙酸或乳酸)，或者是与例如水混合的。奶可以是未加工的或者是加工的，例如通过过滤、灭菌、巴氏杀菌、均质化等，或者是重建的奶粉。根据本发明，“牛奶”的一个重要例子是巴氏杀菌的牛奶。应理解，奶可以在接种细菌之前、过程中、和/或之后被酸化、混合或加工。术语“发酵的奶产品”指预期用于动物更具体用于人消费的、通过乳酸菌对牛奶基质的酸化乳酸发酵而得到的产品。此类产品可包括第二成分，例如水果、蔬菜、糖、调味剂
坐寸o术语“发酵的食品或饲料产品”指预期分别用于人或动物消费的、通过乳酸菌对合适基质的酸化乳酸发酵而得到的产品，所述基质诸如例如奶、果汁、葡萄酒、啤酒和酱油。此类产品可包括第二成分，例如水果、蔬菜、糖、调味剂等。“发酵”指一种生化反应，其中包括通过微生物的作用从有机基质释放能量。更具体地，“乳酸发酵”是一种厌氧或微氧过程，其中发酵物中的细菌消耗乳糖等，从而形成乳酸，还可能形成乙酸，并降低了 pH。本文中术语“呼吸”指一种生化反应，包括在氧气和血红素来源的存在下从有机基质释放能量。具体而言，几个乳球菌菌株已显示在呼吸条件下培养时生长旺盛并进行呼吸。本上下文中，发酵的奶“引子培养物”是包含至少一种乳酸菌菌株例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)或嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的细菌培养物。因此,通过接种奶并用加入的菌株来发酵奶来获得发酵的奶产品。
本上下文中，术语在合适的包装中“包装”(合适量)的发酵食品或饲料产品涉及发酵食品或饲料产品的最后包装以获得能够被受试者或一组受试者摄入或者能够被给予受试者或一组受试者的产品，所述受试者诸如人或动物。因此合适的包装可以是瓶子、盒子(carton)或类似的，合适的量可以是例如10mL-5000mL或50mL-1000mL。本上下文中的术语“细菌(bacteria)”为其复数形式，因为本文中讨论仅包含一个单独的细菌的组合物是没有意义的。如本文所用，术语“乳酸菌”指革兰氏阳性的微需氧或厌氧细菌，其发酵糖，产生酸，包括乳酸(最主要产生的酸)、乙酸和丙酸。工业上最有用的乳酸菌可在“乳酸杆菌(Lactobacillales)”目中找到，包括乳球菌属(Lactococcus spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、明串珠菌属(Leuconostocspp.)、片球菌属(Pediococcus spp.)和肠球菌属(Enterococcus spp.),也可在“放线菌(Actinomycetales)”目中找到，包括短杆菌属(Brevibacterium spp.)和丙酸杆菌属(Propionibacterium spp.)。另外，属于严格厌氧菌的产乳酸的细菌，双歧杆菌(bifidobacteria),即双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)一般包括在乳酸菌中。这些细菌通常单独或与其他乳酸菌一起用作食品培养物。术语“分离的细菌”或“分离的乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675”应理解为分别是在合适的培养基例如奶或公知的细菌培养基例如M17培养基中经合适的发酵后分离的细菌或乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675细菌。本领域技术人员能够用本领域公知的技术发酵和分离/收获细菌，例如通过离心来分离/收获。本上下文中，术语“突变体”应理解为通过例如基因工程、辐射、UV光、化学处理、和/或其他能够引起基因组变化的方法而从本发明的(或本发明所用的)菌株衍生而来的菌株。优选地，突变体是功能等同的突变体。本发明菌株的优选突变体是高产维生素K的突变体，例如该突变体与母菌株具有基本相同的或改善的产维生素K的特性。这种突变体是本发明的一部分。具体地说，术语“突变体”指对菌株(例如本发明的菌株)用常用的诱变处理包括用化学诱变剂例如甲基磺酸乙酯(EMS)或N-甲基-N’ -硝基-N-硝基胍(NTG)、UV光来处理而获得的菌株，或指自发发生的突变体。突变体可能已经经过几次诱变处理(一次处理应理解为一个诱变步骤然后加筛选/选择步骤)，但本发明中优选进行不多于20次，或不多于10次，或不多于5次诱变处理。在本发明优选的突变体中，与母菌株相比，细菌基因组中少于1%、或少于0.5%或少于0.1%或甚至少于0.01%的核苷酸被改变为另一种核苷酸、被缺失、或插入了另外的核苷酸。突变体也可以是自发突变体。对本领域技术人员很清楚的是，通过使用本发明保藏的菌株作为起始材料，阅读了本文的本领域技术人员能够容易地用常规的诱变或再分离技术来获得本发明菌株的另外的突变体或衍生物，这些突变体或衍生物保留了本文描述的相关特点和优势。因此，术语“由其衍生的菌株”指用本发明保藏的菌株作为起始材料而获得的突变体菌株。本上下文中，术语“变体”应理解为与本发明菌株功能等同的菌株，例如具有基本相同的或改善的特性(例如，在粘度、凝胶硬度、粘附感(mouth coating)、风味和/或后酸化方面)。这些变体可用合适的筛选技术来鉴定，并且这些变体也是本发明的一部分。在描述本发明的上下文中(尤其是在下述权利要求的上下文中)，使用“一”和“这”(或该、其)应解释为包括单数和复数，除非本文另有说明或上下文明确有抵触。术语“含有”、“具有”、“包括”、“包含”应解释为开放式术语(即意为“包括但不限于”)，除非另有说明。本文描述数值范围仅意在作为分别提及该数值范围内各个独立数值的快捷方法，各个独立数值包括在说明书内，如同本文分别提及它们一样。本文描述的所有方法可以任何合适的顺序进行，除非本文另有说明或上下文明确抵触。使用本文提供的任何和所有实施例或示范性语言(例如，“诸如”)仅意在更好地解释本发明，不对本发明的范围构成限制，除非另有说明。说明书中的任何语言都不应解释为将任何非权利要求元素表示为是本发明的实施所必需的。发明的实施和各个方面本发明的发明人在筛选几种乳酸菌菌株尤其是乳酸乳球菌种的过程中发现，乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675在维生素K2的生产中非常优异，产生了多达22y g/100mL或220g/L的维生素K2 (参见实施例1)。因此，本发明提供了乳酸菌菌株的生物学纯净的培养物，选择该菌株是因为其能够产生大量的维生素K2。根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约并满足其要求，将本发明的新型乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675的样本在2010年保藏在位于德国Inhoffenstr.7B, D-38124Braunschweig的德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)GmbH，保藏号为DSM23589。乳酸乳球菌乳脂 亚种菌株CHCC12675尤其适于生产发酵的食品和饲料产品，其中通过将该菌接种在合适的基质上和在有利条件下诸如本领域技术人员易知的乳球菌标准发酵条件下发酵，以获得包含乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675的乳酸发酵物。因此，在一个方面，本发明涉及一种生产维生素K2强化的发酵食品或饲料产品的方法，包括:a)用乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675或其突变体或变体接种合适的基质；b)在有利于乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675生产维生素K2和/或有利于该菌株代谢的条件下发酵所述基质；c)任选向基质中加入其他微生物和/或添加剂；和d)任选包装发酵的食品或饲料产品。优选实施方式中，所述发酵食品或饲料产品是发酵的奶产品，其中所述合适的基质是奶。如本领域技术人员所知晓的，通过用不同的乳酸菌发酵牛奶可以获得多种发酵的奶产品。优选实施方式中，发酵的奶产品是选自下述的产品:酸奶、饮用型酸奶(drinkingyoghurt)、搅拌型酸奶、凝固型酸奶(set yoghurt)和酸奶样饮品、苦乳(bitter milk)、酪乳(butter milk)、酸奶油(sour cream)、新鲜奶酪和奶酪。一般而言，本领域技术人员知晓用本文相关细菌来发酵奶的合适发酵条件。此处的合适条件包括但不限于，其中用细菌接种奶，对于乳酸乳球菌，在30° C左右(但是对于使用嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的“酸奶培养物”通常要高出约10° C)发酵直至达到 財.4至4.6(大概约8小时之后)。将奶冷却到+6° C将减缓发酵和乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675的生长。如果需要，本领域技术人员可根据一般常识和有可能经过常规实验来调整标准发酵条件。添加相对大量的LAB至奶中以获得更高的维生素K产量可能是有利的。优选实施方式中，乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675以IX IO6至IX IOltlCFU(菌落形成单位)细菌/ml奶基质接种于奶基质。根据本领域标准方法，通过在琼脂板上的菌落计数定量连续稀释的乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675的菌落形成单位(CFU)数目来检测活细胞数目。合适的培养基和培养条件是本领域技术人员已知的，并示于下文实施例1。如果需要，在某些感兴趣的点(例如，发酵结束之后)，可加入额外的细菌(例如额外的乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675)。步骤a)中可用至少另外一种乳酸菌菌株来接种奶。应理解，可单独/顺序地用各细菌种接种奶，或用两种或多种细菌种同时接种奶。当前优选同时用所有细菌种接种奶。这可以通过用包含细菌种的弓I子培养 物接种奶来方便地完成。根据一种优选实施方式，所述至少一种细菌菌株是下述属的一种或多种细菌:乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、伪明串珠菌属(Pseudoleuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、和双歧杆菌属(Bifidobacterium)。根据本发明的一种实施方式，发酵的奶产品可方便地包装在含有10_5000ml诸如25至3000ml或50至1000ml产品的密封包装中。示范性包装可含有10-300ml、20-200ml或 30-100mlo本文所述的包含乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675的发酵的奶产品也可用作添加剂，例如置于其他可食用食品诸如凝乳酪、巧克力、汁、肉类产品和用于小婴儿(younginfants)的干奶粉产品(婴儿配方奶)中。另一方面，本发明涉及维生素K2强化的并且可通过上述方法获得的发酵食品或饲料产品。再另一方面，本发明涉及包含保藏号为DSM23589的乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675及其突变体和变体的发酵食品或饲料产品。利用公知实验(例如参见Morishita等1999)，本领域技术人员可常规地确定本文所述发酵的食品或饲料产品(例如发酵的奶或酸奶)中维生素K2的量。另外，本领域技术人员可容易地确定本文所述的乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675在发酵食品或饲料产品中的量。最后，本领域技术人员可常规地确定食品或饲料产品中各细菌(菌株)平均存在的维生素K2的平均量，从而常规地鉴定可食用产品中由于CHCC12675细菌的存在而产生了多少的维生素K2。此类的发酵食品或饲料产品可称为功能食品或功能饲料产品，因为其维生素K含量高并且可用于治疗和/或预防维生素K缺乏。本文所述的功能食品或饲料产品可有说明书(例如以标签或小册子的形式)告知消费者产品(例如，发酵奶、酸奶或奶酪)的高维生素K含量。本发明的另一个方面涉及一种增加受试者诸如人、牲畜、或宠物的骨骼强度的方法，该方法包括给予所述受试者维生素K2强化的发酵食品或饲料产品的步骤。本发明另一方面涉及维生素K2强化的乳酸发酵物，该发酵物可通过在本领域技术人员公知以及本文描述的标准发酵条件发酵乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675而获得。如果需要，本领域技术人员可根据一般常识和有可能经过常规实验来调整标准发酵条件。培养基是用于培养乳球菌属菌株的合适培养基。乳酸培养物可以是液体形式、干燥形式、喷雾干燥的、冷冻的、或冻干物形式。根据本发明优选实施方式，乳酸发酵物是干燥的。根据另一种优选实施方式，乳酸发酵物是至少一种冻干物形式。根据本发明一个方面，维生素K2可由包括下述步骤的方法生产:a)在有利于维生素K2生产的条件下培养乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675、或其突变体或变体；b)回收如上述生产的维生素K2。通过上述方法获得的维生素K2和/或乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675、或其突变体或变体，和/或包含该菌株的乳酸发酵物，可用作在用于生产维生素K2强化的可食用产品诸如食品或药物的方法中的组分。根据本发明另一个方面，生产维生素K2强化的可食用产品的方法包括在可食用广品中、在该广品的起始材料中、或在该广品的中间制备物中添加乳Ife乳球囷乳脂亚种囷株CHCC12675、或其突变体或变体、和/或上述方法生产的维生素K2、和/或包含乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675的乳酸发酵物，并获得维生素K2强化的可食用成品。本发明另一方面涉及 可由上述方法获得的可食用产品。本发明还有另外一方面涉及包含保藏号DSM23589的乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCCl2675及其突变体和变体的可食用产品。乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675或其突变体或变体、和/或乳酸发酵物可用预培养的或分离的细菌来实施。细菌可以是新鲜的或冷冻的状态。可选地，在优选实施方式中，细菌是干燥的。优选地细菌是至少一种冻干物的形式。在所有情况下，以完全常规的方式将细菌添加到可食用产品中、该产品的起始材料中、或该广品的中间制备物中。此类维生素K2强化的可食用产品可用于增加哺乳动物诸如人、牲畜或宠物的维生素K水平。在一种优选实施方式中可食用产品可以是食品，在另一种优选实施方式中可食用产品可以是药物。此处可通过本发明方法获得的商业相关的可食用产品是例如发酵的奶食品(诸如乳食品)诸如酸奶或奶酪。因此，优选实施方式中，可食用产品是食品或饲料产品一优选食品。优选地，所述食品是用乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675或其突变体或变体发酵的动物奶，如本文所述——例如优选乳制品。优选地，所述乳制品是至少一种选自以下的乳制品:奶、酸奶和奶酪。优选地，所述动物奶是牛奶或山羊奶。这样的食品可称为功能食品，因为其维生素K含量高并且可用于治疗和/或预防维生素K缺乏。
本文所述的功能食品或饲料产品可有说明书(例如以标签或小册子的形式)告知消费者产品(例如，发酵奶、酸奶或奶酪)的高维生素K含量，如果是药物制剂还可能告知剂量。如上文所述，在另一优选实施方式中，可食用产品是药物。药物可以是胶囊、片剂或粉末的形式。如上文所述，维生素K2是细菌质膜的组分——即维生素K2存在于LAB的膜中。—优选实施方式中，可食用产品包含分离的乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675细菌——优选干燥的或冻干的、分离的乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675、或其突变体或变体。如果可食用产品是固体的，维生素K2的量可检测为U g/mg，通过本领域技术人员所知的方法检测。此类产品的一个例子可例如包含分离的乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675或其突变体或变体的干燥组合物，因此，所述干燥组合物可例如置于药物相关胶囊中，然后例如作为药物出售。本发明的可食用产品和/或乳酸发酵物除含有乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675之外，还可包含其他细菌(例如thyA(-)突变体细菌，或其他类型的乳酸菌，诸如例如，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)。本发明还涉及乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675或其突变体或变体在制备用来治疗和/或预防维生素K缺乏的食品的用途，本发明还涉及乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675或其突变体或变体在制备用来治疗和/或预防维生素K缺乏的药物的用途。如本领域技术人员所知晓的，对本领域技术人员而言术语“维生素K缺乏”是公知的、明确定义的病理状态。

下文描述了与维生素K缺乏相关的一些公知常识。维生素K缺乏是维生素K不足导致的一种维生素缺乏症。维生素K缺乏可能因肠道摄入干扰而发生(例如因胆管梗阻而发生)，可能因治疗性或偶然性摄入了维生素K拮抗剂而发生，或者，非常少见地，由于营养性维生素K缺乏而发生。结果是，Gla残基的形成不足，以及Gla蛋白的活性不足。上述三种过程的失控可导致以下四种:胃痛；无法控制的大出血的风险；软骨钙化；和发育中骨骼的严重畸形或不溶性钙盐沉积在动脉壁上。钙在软组织包括动脉壁中的沉积是很常见的，尤其是在那些患有动脉粥样硬化的人中，这表明维生素K缺乏比先前想到的要更加普遍。如前所述，公知维生素K缺乏与骨骼健康程度降低例如发育中的骨骼的畸形或骨骼强度降低相关。因此，在优选实施方式中，治疗和/或预防维生素K缺乏是为了改善哺乳动物的骨骼健康。骨骼健康的改善可与发育中的骨骼的畸形减少相关。优选实施方式中，治疗和/或预防维生素K缺乏是为了治疗和/或预防骨质疏松症；癌症，诸如前列腺癌；心血管疾病,诸如冠心病。可选地，治疗和/或预防维生素K缺乏是为了治疗和/或预防胃痛；无法控制的出血的风险或软骨钙化。是治疗或者是预防维生素K缺乏一般取决于所用的组合物类型(例如乳制品或药物)。
本发明的某些方面涉及乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675或其突变体或变体在用于制备分别用来治疗和/或预防哺乳动物维生素K缺乏的食品和药物的用途。根据本发明，其他方面涉及:保藏号DSM23589的乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675或其突变体或变体用于治疗和/或预防哺乳动物维生素K缺乏。保藏号DSM23589的乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675或其突变体或变体用于治疗和/或预防哺乳动物骨质疏松症。保藏号DSM23589的乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675或其突变体或变体用于改善哺乳动物的骨骼健康。保藏号DSM23589的乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675或其突变体或变体用于减少哺乳动物发育中的骨骼的畸形。

保藏号DSM23589的乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675或其突变体或变体用于治疗和/或预防哺乳动物胃痛。保藏号DSM23589的乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675或其突变体或变体用于治疗和/或预防哺乳动物癌症。保藏号DSM23589的乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675或其突变体或变体用于治疗和/或预防哺乳动物前列腺癌。保藏号DSM23589的乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675或其突变体或变体用于治疗和/或预防哺乳动物心血管疾病。保藏号DSM23589的乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675或其突变体或变体用于治疗和/或预防哺乳动物冠心病。如果是乳制品(例如酸奶)一该例如的酸奶可出售给“健康”人，因此可看作预防维生素K缺乏(例如“正常”人获得总体骨骼健康的改善并因此预防了骨骼问题)。当组合物是药物时，更可能与治疗明显患病的人有关一一例如，具有发育中的骨骼的严重畸形的人或者患有胃痛的人。简而言之，在本发明上下文中，本领域技术人员能够容易地确定治疗和预防维生素K缺乏之间的差别。商业上，本发明最相关的哺乳动物是人。或者，哺乳动物可以例如是牛、猪、山羊、狗、猫或兔。本领域技术人员可基于一般常识确定应优选给予哺乳动物多少组合物。如果组合物是例如酸奶，当然基本上取决于顾客他/她想要吃多少酸奶。如果组合物是例如药物，医师知晓患者应吃多少药物以获得治疗/预防。下文以非限制性实施例的方式描述了本发明的实施方式。实施例实施例1维生素K2是乳酸乳球菌和其他微生物的细胞膜中呼吸链的必要组分，在细胞膜中维生素K2穿梭电子。因此细胞需要维生素K2才能够呼吸。所以我们推测在呼吸生产条件下生长至高产的细胞可能会产生大量的维生素K2。因此，我们用内部试验测试了乳酸乳球菌种的多种野生型乳酸菌菌株生产维生素K2的能力(数据未显示)。简言之，所述内部试验如下:将呼吸静止培养物中的细胞以0D600=1.0接种于7.5mL新鲜的含有3.5%脂肪的奶，培养约20小时(见下文详述)。发酵后，发酵奶中的脂肪被脂肪酶降解，蛋白沉降。然后通过超声释放甲基萘醌类(MK)，用己烷/氯仿萃取。用HPLC-MS测定样品中MK的量。所用的柱是带有0.45Dm线内过滤器的LiChroCartl25-2, Superspher 100RP-18。流动相是2-丙醇和甲醇的梯度。用MK-4和MK-7标准品来校准试验。然后将最有前景的菌株外部检测(tested externally),如下所述。生长条件为:IOOmL, M17(Difco M17)+1%乳糖，5ppm氯化血红素，在30 ° C下搅拌。取出在IOOmL体积中产生0D6001.0的细胞，然后将这些细胞4° C离心收集。将细胞重悬在3.5%脂肪的5mL “sedmaelk”(来自丹麦 Viby 的 Arla Foods Amba 的“全脂”奶)中。这 5mL4° C 接种
在951^“304^10￡1]￡”中，因此接种水平为00=1.0。30° C培养约20小时后，将样品-20° C冷冻，在干冰上送去 Aquanal (151bis, Avenue Jean Jaures, 33600Pessac,法国)进行维生素K2分析。获得了以下维生素Κ2水平(yg/100mL奶):CHCC4079 (5);CHCC1899 (2);CHCC3143(2);CHCC2862 (9);CHCC12464(22);CHCC12675(26)。因此我们出乎意 料地鉴别出了两个野生型菌株CHCC12464和CHCC12675，分别产生了 22μ g维生素K2/100mL奶和26μ g维生素K2/100mL奶。因此，在生产维生素K2方面，这些菌株分别比我们所知的任何其他野生型LABs高出2.5-倍和3-倍。因此，CHCC12464和CHCC12675本身是有用的菌株，并且它们也可以作为进一步改
善维生素K2生产的良好起点。保藏和专家解决方案申请人:要求，下述的保藏微生物的样品仅可提供给专家，直至本专利授权之日。乳酸乳球菌乳脂亚种菌株CHCC12675于2010-05-06保藏于德国微生物菌种保藏中心 GmbH，Inhoffenstr.7B, D-38124Braunschweig (DSMZ)，并被授予保藏号 DSM23589。保藏是根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约进行的。参考文献Morishita T et al.(1999).J.Dairy.Sc1.82:1897-1903.
Kamao M et al.(2007).Journal of Nutritional Science andVitaminology53:464-470.
Sato T et a 1.(2001).J.0f Industrial Microbiology andBiotechnology26:115-120.
Shearer MJ et al.(1996).J.Nutr.126:1181S-1186.
Schurgers LJ et al.(2007).Bloodl09:3279-3283.
Vergnaud P et al.(1997).J.Clin.Endocrin.Metabol.82:719-724.
Booth SL and Suttie JW(1998).J.Nutr.128:785-788.
Iwamoto J et al.(2009).Nutrition Research (New York，N.Y.) 29:221-228.
Macdonald HM et a 1.(2008).The American J.0 f ClinicalNutrition87:1513-1520.
Vermeer C et al.(2004).European Journal of Nutrition43:325-335.
Aliabadi M et al.(2008).Asia Pacific Journal of ClinicalNutritionl7:285-289.
van Summeren MJH et al.(2008).British Journal of NutritionlOO:852-858.
Nimptsch K et al.(2008).Am J Clin Nutr87:985-992.
Shearer MJ and Newman P (2008).Thrombosis And HaemostasislOO:530-547.
Yokoyama T et al.(2008).Autophagy4:629-640.
Geleijnse JM et al.(2004).J Nutrl34:3100-3105.
Gast et al.(2009).Nutrition, Metabolism and CardiovascularDisease19:504—510.
Beulens JWJ et al.(2009).Atherosclerosis203:489-493.
W02008/040793A1W02008/040784A1W0 2010/139690A

本发明涉及一种新的、维生素K2产量增加的野生型乳酸乳球菌乳脂亚种细菌菌株及其突变体和变体，本发明还涉及生产用于减轻和/或预防维生素K缺乏的维生素K2强化的发酵食品或饲料产品以及维生素K强化的可食用产品的方法。本发明还涉及用本发明的方法可获得的发酵食品或饲料产品以及可食用产品，还涉及野生型乳酸乳球菌乳脂亚种细菌菌株用于治疗和/或预防哺乳动物诸如人的维生素K缺乏。