专利名称：苦碟子注射液作为制备抗病毒药物的应用的制作方法专利说明苦碟子注射液作为制备抗病毒药物的应用 本发明涉及一种中药制剂的新用途，即苦碟子注射液作为制备抗病毒药物的应用。在已有技术中，市售的苦碟子注射液(又称碟脉灵注射液)由通化华夏药业有限责任公司生产，其主要成分为腺嘌呤核苷、总黄酮。功能与主治为扩张冠血管，改善心肌血氧供应，增加纤维蛋白溶解酶活性，抑制血栓形成，用于治疗冠心病、脑血栓、心绞痛、眼底病，在制备抗病毒的药物中的应用未见报道。本发明的目的是针对上述不足而提供一种苦碟子注射液的新用途，即苦碟子注射液作为制备抗病毒药物的应用，增加其适应症。本发明的技术解决方案是苦碟子注射液作为抗病毒药物的应用。苦碟子注射液作为制备抗病毒药物的应用尤指作为抗主要呼吸道病毒和单纯疱疹病毒的药物中的应用。苦碟子注射液可直接作为治疗病毒性肺炎、病毒性流感的药物使用。本发明的优点是揭示了苦碟子注射液新的药用用途，增加了苦碟子注射液的适应症，对病毒性肺炎、病毒性流感有特效。下面将结合药效学实验对本发明作进一步详细描述(苦碟子注射液在如下的药效学研究报告中称“碟脉灵”)。图1是碟脉灵浓度与细胞毒性量效关系曲线示意图；图2是碟脉灵对流感病毒的抑制作用示意图；图3是碟脉灵对腺病毒的抑制作用示意图；图4是碟脉灵对副流感病毒的抑制作用示意图；图5是碟脉灵对柯萨奇B3病毒的抑制作用示意图；图6是碟脉灵对柯萨奇A16病毒的抑制作用示意图；图7是碟脉灵对单纯疱疹病毒I型的抑制作用示意图；图8是碟脉灵体内治疗量效曲线示意图。本发明经吉林大学基础医学院所作的药效学研究报告表明，苦碟子注射液在体内外均具有明显的抗主要呼吸道病毒和单纯疱疹病毒的作用。具体报告内容如下目的对碟脉灵体内外抗病毒作用进行药效检测。方法采用组织细胞培养法、血凝法和建立流行性感冒动物模型，对不同浓度的碟脉灵进行体内外抗病毒药效学研究。结果碟脉灵体外有明显的抑制副流感病毒、腺病毒3型和单纯疱疹病毒I型的作用，对流感病毒、柯萨奇B3病毒和柯萨奇A16病毒有明显的延缓致细胞病变作用。体内抗病毒试验结果显示，碟脉灵可有效抑制流行性感冒病毒所致小鼠病毒性肺炎。
结论碟脉灵在体内外均具有明显的抗主要呼吸道病毒和单纯疱疹病毒的作用。
一、试验材料1.药物1)碟脉灵注射液黄色透明针剂，批号020202，为本实验待测药物。由通化华夏药业有限公司提供。调整PH为7.5，分装，贮于4℃备用。用于体内外抗病毒试验。
2)利巴韦林注射液，100mg/支，由天津药业集团新郑股份有限公司，批号020205，国药准字XF19990698号，作为本次试验阳性对照药物。
2.细胞株Hep-2(喉癌细胞)购于卫生部药品生物制品检定所。
Hela(宫颈癌细胞)本教研室保存。
3.毒株1)流感病毒FM1株购于预防医学科学院病毒研究所2)柯萨奇病毒B3(CVB3)株来源于美国，为本教研室保存3)单纯疱疹病毒I型(HSV-1)SM44株购于卫生部药品生物制品检定所。
4)腺病毒3型(AdV-3)来源于白求恩医科大学一院儿科研究室。
5)柯萨奇病毒A16(CVA16)株 日本仙台国立医院赠本教研室保存。
6)副流感病毒 购于预防医学科学院病毒研究所。
4.主要试剂培养基 IMDM为美国Sigma产品。
胎牛血清 长春生物制品研究所产品。
胰蛋白酶 日本生产上海化学试剂厂分装。
5.实验动物Swiss小鼠雌雄各半，3-4W龄，16-18g，雌雄分别分组，由吉林大学白求恩医学部实验动物中心提供。医动字第10-5219号。
二、方法1.细胞准备Hep-2、Hela传代细胞培养3-5d，使之成片，界线清晰，立体感及折光度强时，用胰酶消化，待细胞面出现针尖样小孔，吸尽消化液，取数毫升培养液吹散细胞，计数，用培养液稀释至约5×107/L后，接种于96孔培养板内，待细胞长成单层。
2.药物毒性测定细胞毒性试验将碟脉灵稀释为0.125g/L，0.0625g/L，0.0312g/L，0.0156g/L，0.00781g/L，0.0039g/L，0.00195g/L，0.00097g/L等浓度。阳性药病毒唑稀释为0.125g/L，0.0625g/L，0.03125g/L等浓度。将上述用培养液稀释好的不同浓度的药品滴加于Hep-2、Hela单层细胞上，每孔0.2ml，37℃ 5％CO2孵箱培养，每天镜下观察细胞病变(CPE)，求出药液致细胞毒性，计算药物对细胞毒性浓度，最大无毒浓度(TC0)，50％中毒浓度(TC50)。
药物对动物毒性实验将不同剂量药物分组给药，观察急性毒性，根据最大耐受量(MTD)和LD0计算出碟脉灵小鼠体内试验药物用量为6ml/kg，12ml/kg，24ml/kg，相当于0.0015g/kg、0.003g/kg、0.006g/kg三个浓度。分别连续给药6天。记录发病或死亡日期和数量，取标本进一步检测。阳性对照药利巴韦林用量为0.13g/kg。
3.药物对病毒致细胞病变作用的影响在Hep-2和Hela细胞上分别加入10-1-10-6不同浓度的6种病毒液，吸附1h后洗去病毒液，加入无毒界限药液，每一病毒稀释度各加3复孔，同时设病毒对照，细胞对照，阳性药物对照组。置37℃CO2培养箱内培养，每天在倒置显微镜下观察病变，连续7d，记录各孔病变情况。计算出抑制细胞病毒的感染量，细胞病变抑制率，最小有效浓度(MTC)，半数有效浓度(IC50)，90％有效浓度(IC90)和治疗指数(TI)。实验重复三次。
4.各种病毒TCID50的测定将各种病毒进行10倍稀释10-1，10-2，10-3......10-6不同稀释度，并将各种稀释度的病毒感染Hep-2和Hela细胞，用96孔塑胶板单层培养。观察细胞病变，测定各病毒半数致细胞病变剂量(TCID50)。
5.结果判定及计算方法以能使50％细胞孔发生CPE的最高稀释度作为终点，用karber法计算病毒滴度。
TCID5050％组织细胞感染量XM病毒最高浓度稀释度的对数d稀释度系数(倍数)的对数∑pi每个稀释度病变百分数的总和6.体内抗病毒试验1)病毒毒力测定乙醚麻醉小鼠，滴鼻感染，每鼻孔不同稀释度病毒0.03ml，记录死亡百分数，计算LD50。
2)药物毒性测定小鼠急性毒性和亚急性毒性，计算LD50及LD0。
3)抗病毒试验小鼠随机分组，10只/组，于感染前一天开始腹腔注射给药，连续5d，对照组腹腔注射相同体积的生理盐水。在乙醚浅麻醉下滴鼻感染流感病毒鼠肺适应株FM1，15LD50，感染后96h解剖，取肺称重，逐个算出肺指数值，与对照组比较，进行组间t检验。统计学处理，计算t值和P值。
4)肺病变组织学和病理学检查取各试验组鼠肺、固定、包埋、切片染色、镜检等，具体方法略。
5)血凝试验检测鼠肺流感病毒增殖和抗原滴度动物分组、药物剂量、给药方法、病毒感染同前。感染病毒72h后，脱颈处死小鼠，解剖取肺，组织匀浆器研磨，生理盐水制成10％的肺组织悬液，离心取上清，倍比稀释，按0.2ml/孔滴于滴定板上后，每孔加入0.2ml 1％鸡红细胞悬液，混匀，置室温30min，观察记录血凝滴度。以红细胞凝集(++)时为終点，并以悬液稀释倍数表示其滴度。
三、试验结果1.各种病毒的TCID50流感病毒FM1logTCID50=-2+0.5-100+100+50100=-4]]>CVB3logTCID50=-2+0.5-100+100+100+50100=-5]]>副流感病毒logTCID50=-2+0.5-100+100+50100=-4]]>HSV-1SM44logTCID50=-2+0.5-100+100+100+30100=-4.8]]>AdV-3logTCID50=-2+0.5-100+100+50100=-4]]>CVA16logTCID50=-2+0.5-100+100+100+30100=-4.8]]>2.药物霉性测定1).药物对细胞毒性测定结果碟脉灵对Hep-2和Hela细胞最大无毒浓度(TCO)为0.0039g/L，半数毒性浓度(TC50)为0.016g/L，具体量效关系见下图。病毒唑稀释为0.0625g/L以上稀释时对Hep-2和Hela细胞均无毒性作用。
碟脉灵浓度与细胞毒性量效关系曲线见图12).动物毒性测定结果该药的半数致死量按最大给药浓度和小鼠的最大静脉注射容积无法求出半数致死剂量(LD50)，求得最大耐受量(MTD)大于1000g生药/kg。
3.碟脉灵对病毒致细胞病变保护作用结果在感染30-100TCID50的6种病毒的情况下，碟脉灵使用浓度为0.0039g/L，碟脉灵对病毒的抑制其致细胞病变作用结果见表1
注-示无细胞病变；±示有延缓细胞病变作用；+示1/4以下的细胞病变；++示1/4～1/2的细胞有病变；+++示1/2～3/4的细胞有病变；++++示3/4以上的细胞有病变。
碟脉灵对流感病毒的抑制作用见图2，IC50＝0.000564g/L，碟脉灵对流感病毒的治疗指数TI=TC50IC50=28.36]]>碟脉灵对腺病毒的抑制作用见图3，IC50＝0.000261g/L，碟脉灵对腺病毒的治疗指数TI=TC50IC50=61.30]]>碟脉灵对副流感病毒的抑制作用见图4，IC50＝0.000273g/L，碟脉灵对副流感病毒的治疗指数TI=TC50IC50=58.60]]>碟脉灵对柯萨奇B3病毒的抑制作用见图5，IC50＝0.000597g/L，碟脉灵对柯萨奇B3病毒的治疗指数TI=TC50IC50=26.8]]>碟脉灵对柯萨奇A16病毒的抑制作用见图6，IC50＝0.001002g/L，碟脉灵对柯萨奇A16病毒的治疗指数TI=TC50IC50=15.96]]>碟脉灵对单纯疱疹病毒I型的抑制作用见图7，IC50＝0.000256g/L，碟脉灵对单纯疱疹病毒I型的治疗指数TI=TC50IC50=62.5]]>4.对小鼠流感病毒性肺炎的影响1).碟脉灵对小鼠肺炎的影响结果，采用EXCEL统计软件，进行两组均数T检验，详见表2。在0.013g/kg/d及以上计量，均有显著的治疗作用。
表2 碟脉灵对小鼠流感病毒性肺炎的作用组别 剂量动物 肺指数值 肺病变减轻 P值(g/kg/d)(只) (x±SD) (％)病毒对照 - 101.581±0.136正常对照 - 101.378±0.061利巴韦林 0.1300 101.382±0.057 12.60 ＜0.01碟脉灵0.0060 101.374±0.044 13.09 ＜0.010.0030 101.496±0.086 5.355 ＞0.050.0015 101.510±0.063 4.463 ＞0.05
2).肺病变组织学和病理学检测结果病毒性肺炎模型组镜下可见支气管、细支气管壁、肺泡壁等肺间质充血、水肿以及淋巴细胞、单核细胞浸润，肺泡壁增宽，肺泡呈炎症反应。碟脉灵治疗各组鼠肺病变明显减轻，部分肺组织形态结构正常，最佳治疗剂量为0.006g/kg。
3).小鼠肺组织中病毒抗原滴度测定---血凝试验结果血凝试验结果详见表3。
表3 碟脉灵对流感病毒性肺炎小鼠肺组织血凝滴度的影响组别 剂量动物血凝滴度 抑制率 P(g/kg/d (只)(x±S) (％))病毒对照 - 10 31.5±1.715正常对照 - 10 0.000利巴韦林 0.1300 10 21.0±2.108 33.33 ＜0.01碟脉灵0.0060 10 22.3±1.494 29.20 ＜0.010.0030 10 26.2±0.632 16.82 ＜0.050.0015 10 30.0±1.329 4.76＞0.05从上表可见，碟脉灵治疗(0.006g/kg、0.003g/kg、0.0015g/kg)组，鼠肺中流感病毒滴度明显低于病毒对照组。最佳治疗剂量为0.006g/kg、0.003g/kg。碟脉灵体内治疗量效曲线见图8，EC50＝0.0196g/kg，碟脉灵对流感病毒的体内治疗指数为TI=MTDEC50=10204]]>结论碟脉灵在体外有明显的抑制副流感病毒、腺病毒3型和单纯疱疹病毒I型的作用，对流感病毒、柯萨奇B3病毒和柯萨奇A16病毒有明显的延缓细胞病变作用。碟脉灵体内抗病毒试验结果显示，在一定浓度范围可有效的抑制流行性感冒病毒所致的病毒性肺炎，与模型对照组比较，差异显著。关于碟脉灵的抗病毒的作用机理有待进一步深入研究。
实施例苦碟子注射液主治用于治疗冠心病、脑血栓、心绞痛、眼底病，病毒性肺炎，病毒性流感。


本发明涉及一种中药制剂的新用途，即苦碟子注射液作为制备抗病毒药物的应用。揭示了苦碟子注射液新的药用用途，增加了苦碟子注射液的适应症，使其不仅用于治疗冠心病、脑血栓、心绞痛、眼底病，同时对病毒性肺炎、病毒性流感也有特效。