一种诱导植物系统抗病性的激发子制作方法

王源超, 张正光, 胡东维

2004年1月28日

2003年6月25日

2003年6月25日

南京农业大学

A01N63/00GK1470173SQ0313198

抗病性 激发子 诱导 植物 系统

1.一种诱导植物过敏性反应的激发子，其特征在于激发子来源于棉花疫霉菌(Phytophthora boehmeriae)，属蛋白类，分子量为10～100kDa，对酸、碱、热稳定；对蛋白酶ProteaseK敏感，N-端氨基酸序列为AVNN，该激发子引起烟草过敏性反应的浓度为0.1-10mM；该激发子的制备方法包括将棉疫病菌在Plich′s培养液(每升含0.5gKH2PO4，0.25g MgSO4·7H2O，1g天冬酰胺酸，1mg硫胺，0.5g酵母浸膏，20g葡萄糖)中培养10天后，采用双层纱布过滤，再采用双层滤纸过滤，加入硫酸铵至70g/100mL，在4℃过夜，12000g离心10分钟，收集粗蛋白沉淀，用1％体积的Tris.HCl，PH为7.4，悬浮，即为粗蛋白激发子；采用快速蛋白液相色谱FPLC纯化阴离子交换色谱，色谱柱SepharoseQFF，流动相A，20mmol/L Tris.HCl pH6.0；B，A+1mol/L NaCl；流速2.5ml/min，30min梯度洗脱，收集活性峰将不同收集管中的蛋白溶液分别脱盐后，稀释100倍，注射烟草，能引起烟草细胞过敏性坏死反应的组分，就收集起来做进一步纯化；疏水相互作用色谱，色谱柱Sepharose PHE HP；流动相A，0.8mol/L硫酸铵20mmol/LTris.HCl pH6.0；B，MiliQ水；流速1.5ml/min，梯度洗脱，收集活性峰(方法同上)，透析后冻干浓缩制成纯品2.权利要求1所述诱导植物过敏性反应的激发子的应用，包括将浓度为0.1-10mM的激发子溶液，注射或喷雾接种在植物叶片上，诱导烟草对烟草花叶病毒、烟草黑胫病菌、烟草青枯病菌、烟草赤星病菌，以及小白菜对炭疽病菌等多种病害的系统广谱抗病性

本发明一种诱导植物系统抗病性的激发子，属于生物技术研究领域专用于从棉疫病菌中制备一种蛋白类激发子，用于防治烟草和小白菜的多种病害真菌是一种重要的激发子生物来源目前已经报道的有来自于酵母细胞壁的寡糖、疫霉属真菌分泌的分子量为10kDa的蛋白类激发子elicitin等这些激发子的共同特点是在植物上引起的过敏性反应，具体表现为接种区植物细胞的快速死亡，形成局部枯斑，从而阻止病原菌进一步扩展并杀死病原菌但到目前为止，未有文献和专利报道从棉疫病菌中分离出本专利申请的一种新的蛋白激发子技术方案1、激发子特性本发明所提供的一种能诱导植物系统抗病性的激发子，来源于棉花疫霉菌，属蛋白类，分子量为90kDa，命名为PB90，对酸碱和热稳定对蛋白酶ProteaseK敏感N-端氨基酸序列为AVNN该激发子定位于疫霉菌的细胞壁上该激发子引起烟草过敏性反应的浓度为0.1-10mM该激发子是通过以下制备方法获得的2、激发子提取与纯化将棉疫病菌在Polich’s培养液(每升含0.5g KH2PO4，0.25g MgSO4·7H2O，1g天冬酰胺酸，1mg硫胺，0.5g酵母浸膏，20g葡萄糖)中培养10d后，采用双层滤纸过滤，加入硫酸铵至70％(w/v)，在4℃过夜，12000g的离心力下离心10分钟，收集粗蛋白沉淀，用1％体积的Tris.HCl(7.4)悬浮，即为粗蛋白激发子；用快速蛋白液相色谱FPLC纯化阴离子交换色谱，色谱柱为SepharoseQFF，流动相A，20mmol/L Tris.HCl pH6.0；B，A+1mol/L NaCl；流速2.5ml/min，30min梯度洗脱，收集活性峰，活性峰测定方法是将收集的溶液稀释100倍后注射烟草叶片，能引起过敏性反应的部分就是活性组分；疏水相互作用色谱，色谱柱Sepharose PHE HP流动相A，0.8mol/L硫酸铵20mmol/LTris.HCl pH6.0；B.MiliQ水；流速1.5ml/min，梯度洗脱，收集活性峰，即为纯化的活性蛋白，分子量为90kDa3、施用方法和应用范围将该激发子稀释至200pM，以每株植物20μL注射植物叶片上，或以每亩3L喷雾接种在植物叶片上，可以诱导烟草对烟草花叶病毒、烟草黑胫病菌、烟草青枯病菌、烟草赤星病菌，以及小白菜对炭疽病菌、软腐病等多种病害的系统广谱抗病性，诱抗效果可以持续15天以上系统抗病性效果高达80％以上有益效果本发明所提供的一种能诱导植物系统抗病性的激发子，与其他激发子比较，具有如下优点和积极效果本发明所提供的疫霉菌90kDa蛋白激发子诱导植物系统获得抗病性的作用浓度低，只需0.1mmol.L-1就可以诱导烟草和白菜对不同病原菌的抗病性高达85％以上而现有技术中来源于植物病原细菌的Harpin类蛋白诱导植物抗病性所需浓度为20mmol.L-1以上，比本研究所提供的激发子活性低1000倍以上因此本申请所提供的激发子具有更强的生物活性(四)说明书附1，激发子纯化色谱图，HP1为活性峰图2，纯化蛋白的SDS-PAGE电泳图3，激发子诱导抗病性，A激发子诱导烟草对TMV抗性；B激发子诱导烟草对赤星病的抗性图4，激发子的免疫金标记定位于疫霉菌的细胞壁采用快速蛋白液相色谱FPLC纯化过程阴离子交换色谱，色谱柱SepharoseQFF，流动相A，20mmol/L Tris.HCl pH6.0；B，A+1mol/L NaCl；流速2.5ml/min，30min梯度洗脱，收集活性峰，活性峰的测定方法是将不同收集管中的蛋白溶液分别脱盐后，稀释100倍，注射烟草，能引起烟草细胞过敏性坏死反应的组分，就收集起来做进一步纯化；疏水相互作用色谱，色谱柱Sepharose PHE HP；流动相A，0.8mol/L硫酸铵20mmol/LTris.HCl pH6.0；B，MiliQ水；流速1.5ml/min，经过50分钟梯度洗脱，收集活性峰(色谱图见